糖尿病肾病患者NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化水平与危险因素分析

刘恺远 牟新

糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）作为糖尿病常见的微血管并发症之一，以持续尿蛋白及肾功能下降为主要临床表现，是导致终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）的最主要病因之一[1]。DKD的病因及发病机制错综复杂，包括表观遗传（主要包括DNA甲基化）、终末糖基化产物形成、血流动力学异常、炎症反应和细胞因子、氧化应激及肾小球足细胞损伤、肠道菌群改变等[2-5]。越来越多的证据提示表观遗传在DKD发病过程中起重要作用，内外环境因素改变引起表观遗传变化，例如长期高糖环境引起的DNA甲基化与DKD的发生密切相关[6]。本研究采用甲基化特异性PCR法（methylation-specific PCR,MS-PCR）及非甲基化特异性PCR法（non-methylation-specific PCR,UMS-PCR）检测 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化水平，探讨甲基化水平与危险因素的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016年10月至2017年10月杭州市红十字会医院收治的单纯糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者（DM组）及DKD患者（DKD组）各20例。另择同期体检健康者20名作为对照组。DM组男10例，女 10例，年龄 38～83（62.6±11.15）岁；DKD 组男 14例，女 6例，年龄37～80（64.15±11.86）岁；对照组男10例，女10例，年龄47～69（60.40±5.64）岁。3组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。纳入标准：对照组既往身体健康，无糖尿病等慢性病；DM组符合1999年WHO糖尿病诊断及分型标准中糖尿病诊断且非DKD患者；DKD组有明确的糖尿病病史，尿白蛋白排出率在6个月内连续2次＞20 μg/min（或＞30 mg/24 h），或蛋白尿（＞0.5 g/24 h），或肾脏穿刺证实符合DKD诊断[7]。排除标准：原发性肾脏病及其他肾脏病，肾动脉狭窄性高血压；半年内恶性高血压、心脑血管意外、高血糖高渗性昏迷等急危重症病史者；合并有心、肝、肺、脑和造血系统等严重原发性疾病，精神病者；癌症、妊娠及哺乳期者。本研究经本院医学伦理委员会审核通过[批准文号：（2020）快审第（198）号]，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集所有对象血压、身高、体重等一般资料。采用自动血生化分析仪（宁波瑞源生物科技有限公司）检测血肌酐、尿素氮、FPG等指标。采用全自动糖化血红蛋白分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、高压液相色谱法检测糖化血红蛋白（hemoglobin A1C,HbA1C）。采用全自动尿生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、免疫透射比浊法和苦味酸法检测尿微量白蛋白与肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio,UACR）。

1.2.2 全血DNA提取及亚硫酸氢钠修饰 收集所有对象肘静脉血2 ml，用DNA提取试剂盒提取静脉血中的DNA，用微量紫外分光光度计测定260 nm和280 nm吸光值（A），计算DNA含量，-80℃冰箱保存备用。应用甲基化试剂盒按照说明书进行DNA亚硫酸氢钠修饰处理。

1.2.3 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因 DNA甲基化水平检测 采用MS-PCR和UMS-PCR法。将亚硫酸氢钠处理过的DNA用甲基化引物及非甲基化引物分别进行扩增。引物由Methyl Primer Express v1.0设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系 为 50 μl，其 中 H2O 34.8 μl，5×buffer GC 10 μl，dNTP 1 μl；Primer 1 μl，Primer 1 μl，Template 2 μl，Taq 0.2 μl。PCR条件及设定反应程序：95℃预变性3 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，运行40个循环，72℃修复延伸7 min结束反应。由于直接用甲基化引物扩增不理想，先用巢式引物扩增后，稀释40倍作为模板扩增甲基化和非甲基化引物。使用180 V、50 min、1.2%的琼脂糖电泳，置于凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）上拍照保存备检。采用Image J软件分析MS-PCR条带灰度值（M）和UMS-PCR条带灰度值（U），甲基化率=M/（M+U）。PCR引物序列、产物大小见表1。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用非参数检验。计数资料组间比较采用χ2检验。血清AKR1B1基因DNA甲基化相关因素分析采用线性相关性检验和多元线性回归法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床指标比较 DM组、DKD组FPG、HbA1C均高于对照组（均P＜0.01）。DKD组BMI高于对照组（P＜0.05），血尿素氮水平高于对照组及DM组（均P＜0.05），UACR高于DM组（均P＜0.01）。见表2。

表2 各组临床指标比较

2.2 各组 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率比较 DKD组FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率较DM组升高，DM组甲基化率均较对照组升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。3组NTN4、MTHFR甲基化率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。3组对象 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1 DNA基因的MS-PCR及UMS-PCR扩增电泳图见图1。

图1 3组对象NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因的MS-PCR及UMS-PCR扩展产物电泳图

表3 各组 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化率比较（%）

2.3 DKD患者AKR1B1甲基化率的危险因素分析对DKD患者的AKR1B1基因危险因素进行分析，包括年龄、BMI、血肌酐、LDL-C、糖尿病病程、HbA1C、UACR等指标，结果显示，AKR1B1基因DNA甲基化率与HbA1C、UACR 均呈负相关（r=-0.593、-0.564，均 P＜0.05），见表4。将HbA1C、UACR纳入多元回归分析，结果显示，HbA1C、UACR与AKR1B1基因DNA甲基化率相关（β=-0.517、-0.471，均P＜0.05），HbA1C、UACR越高，AKR1B1基因DNA甲基化率越低，见表5。

表4 DKD患者AKR1B1基因DNA甲基化率的危险因素分析

表5 DKD患者AKR1B1基因DNA甲基化率危险因素的多元回归分析

3 讨论

表观遗传学是不涉及DNA结构变化的可遗传性改变，其中DNA甲基化是最主要表观遗传方式之一[8]。DNA甲基化的是在二核苷酸胞嘧啶上添加一个甲基的化学修饰过程。研究发现，高糖等异常环境因素影响下，DNA甲基化状态发生改变，会使基因表达发生上调与下调，最终损伤肾脏，DNA甲基化参与了DKD的发病过程[9]。Sapienza等[10]通过西班牙和非洲裔美国ESRD及单纯DM两组患者的唾液样本，比较了14 000个DNA甲基化的差异基因，得出 NTN4、MTHFR、FZD2、AKR1B1等 39个基因与DKD进展密切相关。本研究未采用上述研究的唾液样本，采用外周血样本为对象研究DNA甲基化情况，结果提示DKD患者血液中FZD2及AKR1B1基因DNA甲基化水平显著高于DM组和对照组；在NTN4、MTHFR基因DNA甲基化中未观察到差异。提示FZD2、AKR1B1基因血中的甲基化率升高可能参与了DKD的发病过程。

卷曲蛋白2（frizzled2,FZD2）属于卷曲蛋白家族系统，是WNT信号通路的重要配体之一，对于FZD2目前研究集中在癌症细胞生长与侵袭上，FZD2蛋白能通过肝细胞、乳腺上皮细胞上皮到间充质改变，使乳腺癌、肝癌等癌症侵袭性增强[11-12]，但FZD2基因DNA甲基化对DKD影响是否同样通过上皮细胞EMT改变达成尚不明确。

有研究证实，AKR1B1基因通过全基因组关联，是目前已发现的几个DKD的遗传因子之一[13]，足以证明其在DKD发病中的重要作用，AKR1B1是编码醛糖还原酶（aldose reductase,AR）的基因，AR参与了经典的多元醇通路，是该通路极为关键的限速酶，会导致山梨醇堆积，增加了氧化应激，使细胞内呈高渗状态、细胞水肿、缺氧，从而导致肾脏、眼底及周围神经的损伤[14-15]，在临床上AR抑制剂如依帕司他治疗DKD、糖尿病视网膜病变及周围神经病变效果显著[16]。本研究结果提示，在DKD组中AKR1B1基因DNA的低甲基化水平与HbA1C及UACR增高有关，提示在DKD患者中AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，血糖及尿蛋白水平越高，与Ademir等[17]的研究结果相似。由此推断AKR1B1基因可能有潜力成为DKD的早期生物标志物，AKR1B1基因DNA甲基化可能通过多元醇途径影响DKD的进展。

NTN4、MTHFR基因DNA甲基化率无明显变化，可能此两个基因发生的甲基化改变主要集中在唾液样本中，而非血液中，也证实相同一个基因在人体不同组织中甲基化率也存在差异[9]。

综上所述，FZD2、AKR1B1基因DNA甲基化可能参与了DKD的发生、发展过程，AKR1B1基因DNA甲基化程度与HbA1C及UACR之间呈负相关。但本研究有一定局限性，未测定24 h尿蛋白量，在DKD早期，UACR准确性与24 h尿蛋白基本等同，但在大量蛋白尿期仍需测定24 h尿蛋白量，有待后续进一步研究证实。