NFKB1基因多态性与原发性高血压及血清TNF-α的相关性研究

李超 李俊 盛晓生 余晗俏

原发性高血压（essential hypertension,EH）是心脑血管疾病的重要危险因素，具有发病率高、致残率高、致死率高等特点，但其发病机制尚不明确[1]。近年来，越来越多的证据支持遗传和环境因素相互作用参与EH的发生、发展[2]。此外，单个基因的碱基缺失/插入、置换/易位等不同的遗传变异也与EH的易感性有关[3-4]。NF-κB是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要转录因子，调节炎症基因如TNF-α、IL-6启动子区表达的调控[5]，参与动脉粥样硬化、关节炎、高血压、肿瘤等多种疾病的病理过程。有研究表明，TNF-α通过NF-κB信号传导发挥作用，促进内皮细胞炎症反应，引起血管收缩，导致血压升高[6]。NFKB1基因位于人类染色体 4q24，编码NF-κB亚单位p105与p50，影响NF-κB表达[7]。NFKB1启动子单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点由插入/缺失（-94ins/del-ATTG）组成（rs28362491），可以诱导NFKB1基因的调节作用，与各种炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症有关[8]，但NFKB1-rs28362491基因多态性与EH的相关性及具体分子机制鲜有报道。本研究探讨NFKB1-rs28362491基因多态性与EH及TNF-α水平的相关性，为预测EH发病风险提供一定的科学依据，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2017年6月至2020年6月就诊于金华市人民医院EH患者275例（EH组）和血压正常的健康体检者138名（NT组）。EH组男154例，女121例，年龄 55～88（64.37±9.82）岁；NT组男81例，女57例，年龄41～73（62.73±5.83）岁，两组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。高血压诊断标准：在未使用抗高血压药物的情况下，非同日3次测量，收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg；患者既往有高血压史，目前正在服用抗高血压药物，血压虽＜140/90 mmHg，也诊断为高血压[9]。排除标准：患有睡眠呼吸暂停低通气综合征、肾实质性高血压、肾血管性高血压、原发性醛固酮增多症、嗜铬细胞瘤或皮质醇增多症，长期服用激素类、中枢神经类、非类固醇类抗炎药物者。本研究经过本院医学伦理委员会审核通过（批准文号：IBR-2017005-R），受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集所有受试者空腹肘静脉全血5 ml，置于紫色抗凝管，再按顺序编号放入EP管。按照血液基因组DNA提取试剂盒配套说明书（上海生工生物工程有限公司，批号：B518253-0050，规格：50 PREPS）进行DNA提取。使用美国Thermo公司Nano Drop 2000C型紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，DNA浓度50 ng/L，放入-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 NFKB1基因上游启动子区域-94位点基因型检测 设计PCR引物，上游引物：5'-TGGGCACAAGTCGTTTATGAT-3'；下 游 引 物 ：5'-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件：模板 DNA 1.5 μl，PCR mix 12.5 μl，上下游引物 0.4 μl，灭菌超纯水10.2 μl，将PCR反应体系的总体积加至25 μl。反应条件：94℃预变性10 min，94℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 45个循环，最后70℃总延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭染色，凝胶成像系统中进行曝光成像并拍照。

1.2.3 血清指标检测 抽取受试者清晨空腹肘静脉血5 ml，EDTA抗凝管收集，使用ALLEGRAX-15R医用低速离心机，1 000 r/min，离心15 min，将血清置于-80℃冰箱保存。采用全自动生化分析仪（日本日立，型号：7180）检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,试剂盒购自美康生物科技股份有限公司，批号分别为180409101、180319201、180601114、180613115。采用全自动酶免分析仪（山东博科生物产业有限公司，型号：BIOBASE2000）、ELISA法检测血清TNF-α水平，试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，批号：ZN2460。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用二元logistic回归分析EH的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象一般资料比较 两组对象BMI、吸烟史、饮酒史、LDL-C、TC比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），余指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组对象一般资料比较

2.2 NFKB1基因rs28362491位点电泳及测序结果NFKB1基因rs28362491位点其PCR产物长度为326 bp，经琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型：野生纯合（ins/ins,Ⅱ）基因型者，只含240 bp 1个条带；杂合突变（ind/del,ID）基因型者，含有281 bp及240 bp 2个条带；纯合突变（del/del,DD）基因型者，只含281 bp 1个条带。见图1。

图1 NFKB1基因rs28362491位点酶切产物电泳图

2.3 两组对象基因多态性分布比较 NFKB1基因rs2836249位点的基因型及等位基因频率在EH组和NT组的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.472、1.185，均P＞0.05）。EH组NFKB1基因rs28362491位点DD基因型频率高于NT组，Ⅱ、ID基因型频率低于NT组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两组D、I等位基因频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两组隐性模型（DD比ID+Ⅱ）分布差异有统计学意义（P＜0.05），但两组显性模型（ID+DD比Ⅱ）分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组NFKB1基因rs28362491位点基因多态性分布[例（%）]

2.4 EH危险因素的logistic回归分析 将是否患有EH作为因变量，EH相关危险因素如年龄、吸烟、饮酒、BMI、糖尿病、TG、TC及NFKB1基因 rs28362491位点DD基因型作为自变量。在校正吸烟、饮酒、BMI、高血压等因素后，DD基因型仍是EH的独立危险因素（OR=1.729，95%CI：1.135～3.926，P＜0.05），见表3。

表3 EH危险因素的logistic回归分析

2.5 两组对象及不同基因型者TNF-α水平比较 ET组血清TNF-α水平为（3.22±0.83）pg/ml，高于NT组的（2.75±0.84）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.01）。DD基因型对象血清TNF-α水平为（3.51±0.91）pg/ml，高于Ⅱ+ID基因型对象的（3.24±0.78）pg/ml，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

EH是常见的慢性疾病之一，中国18岁及以上的居民发病率约27.9%，且患病率仍呈升高趋势[9]。长期EH易并发心、脑、肾等血管疾病，且EH目前无法治愈，已成为影响人类健康的公共卫生问题。因此，对高血压发病机制的研究并制定相应的治疗对策是近年来研究热点[10]。国内外研究证实，炎症与EH的发生、发展及转归密切相关[11]。NF-κB是一种重要的多功能核转录调控因子，其介导信号通路是炎症反应的调节中枢[12]。激活的NF-κB能使下游炎症相关因子如TNF-α、IL-8过度表达，一方面，这些炎症因子诱导血管壁产生炎症反应，刺激血管平滑肌细胞的增殖，进而生血管重塑，最终促进血压升[13]；另一方面，这些细胞因子对NF-κB的正反馈，可进一步活化NF-κB，造成持续或放大的炎症反应来调节炎症因子的表达[14]。

NF-κB是由 p65（RelA）、c-Rel、RelB、NFKB1（p50/p105）、NFkB2（p52/p100）组成，其中 NFKB1基因编码的p50蛋白常以p50/p65异源二聚体和p50/p50同源二聚体两种结合形式发挥功能[15]，影响NF-κB信号通道表达。p50/p65异源二聚体是人体内最常见且含量最丰富的二聚体，可通过增加炎症细胞因子的转录而具有促炎症性质，例如TNF-α和IL-12，而p50/p50同型二聚体通过刺激抗炎细胞因子的转录具有抗炎作用，例如IL-10[16]。rs28362491位点是NFKB1基因中唯一具有表达功能的SNP，表现为ATTG碱基的插入/缺失，编码Ⅱ、ID、DD 3种基因。既往研究表明，在不同人群中，携带NFKB1基因rs28362491 D等位基因或DD基因型的携带者体更易患慢性炎症性疾病，如冠心病、肿瘤、系统性红斑狼疮[17-18]，但与EH相关性研究不多。本研究探讨NFKB1-94ins/del ATTG基因多态性在EH人群的分布，结果显示EH组NFKB1基因rs28362491位点DD基因型和D等位基因分布频率显著高于NT组；在校正其它危险因素后，携带DD基因型人群EH发病风险增加1.729倍，提示D等位基因可能是EH发生的遗传易感基因，但具体发病机制仍不明确。

TNF-α是重要的促炎因子，通过内皮功能破坏和平滑肌细胞增殖，产生的氧自由基可直接使平滑肌收缩或间接使内皮依赖性舒张因子失活，增加收缩血管效应，与高血压病的发生、发展密切[19]。NFKB1作为NF-κB蛋白家族组成部分，与炎症反应介质关系密切。本研究结果证明，EH组患者血清TNF-α水平明显高于NT组，此外，NFKB1-94ins/del ATTG DD基因型携带者的血清TNF-α水平高于ID基因型和Ⅱ基因型。笔者推测，NFKB1-rs28362491位点ATTG缺失（等位基因D），影响NF-κB转录效率，p50蛋白合成减少，引起p50/p65异源二聚体和p50/p50同源二聚体失衡，刺激TNF-α的产生，最终使机体处于炎症过度表达的状态。

综上所述，NFKB1基因rs28362491位点多态性是EH的独立危险因素，D等位基因可能通过调节血清TNF-α的水平成为易感等位基因，影响EH的发生、发展。本研究存在一定的局限性：EH是一种多基因疾病，需进行基因-基因交互作用以及基因-环境交互作用方面的研究；本研究样本量少，为横断面研究，不能像队列研究一样预测因果关系；NFKB1基因调节多种炎性细胞因子，本研究仅观察TNF-α，今后还需进一步扩大炎症因子范围深入研究。