程序性细胞死亡在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用研究进展

白杨 史冀华 张水军

原发性肝癌、肝硬化等严重威胁着人民的生命健康，肝移植是目前治疗这些严重肝病的重要手段。在肝移植过程中，不可避免地会发生肝组织缺血，缺血肝组织在重新获得血流灌注及氧供后，细胞功能结构不能及时恢复，反而较缺血时加重，导致细胞死亡、组织坏死、器官进一步恶化的综合征，称为肝脏缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI），严重制约肝移植的临床治疗效果。

根据发生阶段和原因的不同，HIRI可分为热缺血损伤和冷缺血损伤。热缺血损伤一般发生在肝切除、心脏死亡供者供肝肝移植以及肝缺血性休克期间，以肝实质细胞损伤为主，可导致肝脏甚至多器官衰竭[1]。冷缺血损伤常发生在供肝冷保存阶段，常见于肝窦内皮细胞损伤和微循环障碍[2]。

HIRI的病理生理过程复杂，发生机制尚未完全阐明，目前认为HIRI与钙超载、氧化应激损伤、酸中毒、内毒素损伤、补体激活等机制相关[3]。当前认为在热缺血损伤中，缺血、缺氧会直接导致肝实质细胞损伤。在冷缺血损伤中，内皮细胞损伤是HIRI的始动因素，可引起肝脏枯否细胞激活、中性粒细胞浸润、血小板激活、细胞因子释放，触发局部无菌炎症反应，导致血管持续收缩、微循环障碍，甚至肝功能障碍[4]。程序性细胞死亡是一种依赖于特定分子机制的细胞死亡形式，可以被药物或基因调控，包括细胞凋亡、铁死亡、坏死性凋亡、细胞焦亡、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）-1依赖性细胞死亡等，现已成为HIRI的研究热点，本文就肝脏缺血-再灌注过程中程序性细胞死亡方式的研究进展予以综述。

1 细胞凋亡

1972年，Kerr等[5]首先提出了细胞凋亡的概念，用来描述一种形态上与细胞坏死截然不同的细胞死亡形式。其主要的形态学特征为细胞体积缩小，连接消失，细胞质密度增加；线粒体膜电位消失，通透性改变；核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为180～200 bp的片段；胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，形成胞膜结构完整的凋亡小体。根据起始阶段启动途径的不同，凋亡可分为内源性细胞凋亡和外源性细胞凋亡[6-7]。内源性细胞凋亡是由细胞内微环境改变引发的一种程序性细胞死亡形式，如内质网应激、DNA损伤、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）超载、有丝分裂缺陷或者微管改变等[6,8]。细胞微环境异常引发的刺激导致线粒体外膜上B细胞淋巴瘤（B cell-lymphoma，Bcl）-2基因家族促凋亡蛋白的寡聚化，形成蛋白脂质孔道，增加线粒体外膜通透性，导致促凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞浆中，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3、6、7、9的活化。活化的Caspase进一步导致DNA片段化、磷脂酰丝氨酸暴露和凋亡小体的形成，引发细胞凋亡。外源性细胞凋亡是由细胞膜受体检测到的细胞外微环境的异常所引发的细胞凋亡，通常由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族成员触发，包括TNF本身、人凋亡相关因子配体（FasL）和TNF相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）等[9]。死亡受体与配体结合后募集衔接蛋白和起始蛋白原，形成死亡诱导信号复合物，进而激活Caspase，引发下游级联反应，导致细胞凋亡。Caspase-8和Caspase-10也可以在复合体内自我激活，并直接激活Caspase-3，进一步导致DNA降解和细胞凋亡[10]。

细胞凋亡是目前HIRI过程中研究最多的细胞死亡方式，HIRI会促进凋亡，使肝细胞再生受阻，最终导致原发性肝衰竭和移植后移植物长期功能障碍。研究表明，缺血阶段损伤主要表现为细胞坏死，再灌注阶段损伤主要表现为细胞凋亡，并与缺血时间、程度和再灌注情况有关[11]。在冷缺血期间，凋亡主要发生在非实质细胞，在热缺血和再灌注后，实质细胞和非实质细胞均可发生细胞凋亡。HIRI时，细胞凋亡是一个不断发生的动态过程，细胞表面分子受到诱导因子刺激后将信号传入细胞，形成级联式信号转导，通过启动其自身内部的基因表达，最后导致细胞死亡。

研究发现抑制凋亡可达到保护肝功能的目的。Caspase-3的激活是凋亡细胞DNA降解的前提，Cursio[12]发现抑制这些蛋白水解酶的激活可明显减轻HIRI。加入外源性环磷酸腺苷可以明显减少肝细胞凋亡[13]，应用超氧物歧化酶等抗氧化剂也可减少自由基的产生，显著减少细胞凋亡[14]。对于凋亡相关基因的干扰抑制同样能达到减轻HIRI的目的。其它如一氧化氮等在肝移植过程中对肝脏也起到了一定的保护作用。

2 自噬及自噬依赖性细胞死亡

1963年，de Duve[15]首次提出并描述了细胞自噬现象。1992年，Takeshige等[16]利用酵母突变体确定了参与自噬过程的基因，奠定和推进了自噬的研究进展。自噬是一种受调控的细胞分解代谢过程[17]，负责在生物合成过程中清除长寿蛋白、受损细胞器和畸形蛋白质，维持细胞内环境稳定和能量平衡[18]。根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为宏自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬。在自噬过程中，由双层膜囊泡构成的自噬小体可吞噬细胞内容物质，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解吞噬内容物质[19]。自噬通过对细胞内物质的降解和再循环，维持了细胞自身的新陈代谢，对细胞存活和恢复内部稳态起到了重要作用[20]。自噬依赖性细胞死亡是一种受调控的细胞死亡方式，仅取决于自噬机制，需要通过相关手段抑制自噬可阻止细胞死亡来确认，同时需排除凋亡、坏死等细胞死亡机制。自噬依赖性细胞死亡方式的标准过于严格，目前相关报道较少。

在正常肝脏中，自噬维持在一个较低水平，以维持肝脏的稳态。大部分研究发现肝脏缺血-再灌注后，自噬水平增加[21-23]。HIRI可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路，通过Beclin-1通路激活自噬，肝脏通过自噬降解细胞内物质，维持能量水平并且清除受损的细胞器和蛋白质，促进肝细胞存活。而在严重的肝脏缺血性损伤期间，过度的自噬可能会破坏必需的蛋白质和细胞器，导致细胞凋亡和坏死[24]。然而，自噬在HIRI的作用尚存在很大争议[25]，缺血-再灌注后肝脏的自噬水平增加还是减少以及自噬对肝脏起保护还是损伤作用仍有待阐明。关于HIRI中自噬的研究结果存在差异可能与自噬评价方法不同、缺乏特异性的自噬激动剂或抑制剂等有关。

研究显示，减少自噬可以有效减轻HIRI。在供肝冷保存液中加入自噬抑制剂渥曼青霉素和PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002抑制自噬小体的形成和成熟，可以缓解肝功能障碍和降低受体病死率[24]。使用常温机械灌注的供肝，可以减少肝细胞自噬的水平，增加三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成，提高供肝质量[26]。

3 铁死亡

2012年，Dixon等[27]在研究Erastin通过RAS基因突变诱导细胞死亡机制时发现一种铁离子介导的新型细胞程序性死亡方式，并根据其特征将这种特殊的细胞死亡方式称为铁死亡。当细胞受到刺激时，引发细胞内铁超载及脂质过氧化，胞内谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4活性降低，脂质过氧化物不能被还原反应代谢，从而积聚在胞内，引起线粒体明显萎缩，膜密度增加，线粒体嵴减少伴有嵴丢失和外膜破裂，导致铁死亡[28]。

铁死亡参与了HIRI病理生理过程[29]。HIRI可上调铁死亡标志物环加氧酶和脂质过氧化水平。铁超载是HIRI的一个新的危险因素，在小鼠模型中，高铁饮食增加机体铁负荷，可以加重HIRI[29]。铁死亡主要涉及铁稳态和脂质过氧化代谢的遗传改变，但具体调控机制及其与其他细胞死亡方式是否具有协同作用有待进一步研究。

研究发现抑制铁死亡可以减轻HIRI。Yamada等[29]发现铁死亡特异性抑制剂铁抑制素-1、Liproxstatin-1和α-生育酚可明显减轻肝脏炎症反应，通过去铁胺的铁螯合作用也可以减轻HIRI。目前研究表明铁死亡参与了HIRI，调控铁死亡可干预HIRI，因此明确铁死亡具体机制及下游调控机制，有望为HIRI的治疗提供新的研究思路和治疗策略。

4 坏死性凋亡

2005年，Degterev等[30]提出了坏死性凋亡的概念，用来描述一种在细胞凋亡受抑制的情况下，激活死亡受体依然能诱导细胞死亡的新型细胞死亡形式。坏死性凋亡可通过多种不同的死亡受体激活，包括TNF受体（TNF receptor，TNFR）1、人凋亡相关因子配体受体（Fas）、Z-DNA结合蛋白（Z-DNA binding protein，ZBP）1或病原体识别受体等[31]。死亡受体激活是否诱导凋亡或坏死性凋亡取决于受体相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIPK）1和RIPK3。Caspase-8激活后裂解RIPK1和RIPK3，逆转平衡导致凋亡，Caspase-8受到抑制后将导致RIPK1/RIPK3复合物的组装，形成坏死小体，坏死小体催化混合谱系激酶结构域样假激酶（mixed lineage kinase domain-like pseudokinase，MLKL） 磷酸化，导致MLKL聚合物形成后转移到胞膜，使胞膜分解，增加胞膜通透性，细胞质和细胞器普遍肿胀，细胞内容物被释放到微环境中，导致坏死性凋亡。

研究表明，在HIRI的病理生理过程中，特别是冷缺血阶段，会导致坏死性凋亡的发生。Zhong等[32]发现，HIRI后RIPK3和MLKL表达水平显著上调，且老龄小鼠坏死性凋亡比年轻小鼠更明显。Lin等[33]发现喂食高脂肪食物的小鼠在HIRI后显示出RIPK3和MLKL表达增加，表明脂肪变性的肝脏更容易发生坏死性凋亡。

研究表明，在HIRI情况下，坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1可有效抑制ROS的产生，减轻炎症反应，且与发生肝脏脂肪变性的野生型小鼠相比，特异性敲除MLKL小鼠的肝脏损伤程度更轻[34]。临床有大量因脂肪变性而废弃的供肝，坏死性凋亡的转化研究可能有助于减轻脂肪变性肝脏的损伤程度，使这些边缘供肝成为潜在的候选移植物。

5 细胞焦亡

2001年，Brennan等[35]提出了细胞焦亡的概念，用来描述一种由Caspase-1激活介导的依赖于焦孔素（Gasdermin D，GSDMD）蛋白家族成员的新型程序性细胞死亡方式。细胞焦亡在形态学上兼具坏死和凋亡的特征。根据启动途径的不同，细胞焦亡可分为Caspase-1依赖的经典途径和Caspase-4、5、11依赖的非经典途径[36]。当细胞受到外界各种刺激时，可以迅速识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，从而激活胞内Caspase-1的活性，启动细胞焦亡经典途径。在以革兰阴性菌表面脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为代表的各种感染因素的刺激下，LPS可以胞吞形式进入细胞与Caspase-4、5、11前体特异性结合并将其活化，启动细胞焦亡非经典途径。活化的Caspase进一步引发细胞核固缩、染色质DNA断裂，同时Caspase激活后裂解GSDMD，裂解后的GSDMD片段会直接诱导细胞膜穿孔、破裂。活化的Caspase还通过剪切白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18前体，形成具有活性的IL-1β和IL-18，并通过穿孔破碎的细胞膜释放到细胞外引发局部和全身炎症反应[37]。研究表明，Caspases引发的级联反应是调控细胞死亡或炎症的中心环节[38]。

研究表明，HIRI可激活Caspase-1依赖的细胞焦亡经典途径，活化的Caspase-1在再灌注后1 h表达增多，并一直持续至再灌注后6 h，激活炎症反应通路[39]。HIRI还会激活Caspase-11依赖的细胞焦亡非经典途径。再灌注时，肠道内革兰阴性菌可随血液由肝门移位入肝释放LPS，激活枯否细胞的胞内因子核因子（nuclear factor，NF）-κB，促进Caspase-11的转录与翻译；另一方面，LPS以胞吞形式进入枯否细胞，与Caspase-11在胞内结合，并将其活化，启动细胞焦亡非经典途径[40]。

抑制细胞焦亡可以有效减轻肝脏炎症反应。Hua等[41]研究发现，GSDMD基因敲除可保护枯否细胞免受HIRI诱导的细胞焦亡。在小鼠HIRI模型中也证实抑制Caspase-1、11可减少IL-1β和IL-18释放，减轻HIRI。先天免疫细胞的焦亡加重了HIRI，针对焦亡通路的靶点研究可能为临床提供新的治疗策略。

6 PARP-1依赖性细胞死亡

2009年，David等[42]在脑细胞中发现了一种依赖PARP-1的细胞死亡方式，并命名为Parthanatos，即PARP-1依赖性细胞死亡。在形态学上，PARP-1依赖性细胞死亡兼具有细胞凋亡和坏死的一些特征。环境变化或DNA损伤引起的PARP-1过度激活后会造成多聚二磷酸腺苷核糖（poly adenosine-diphosphateribose，PAR）产物的聚集，导致线粒体通透性的增加，引起凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）从线粒体释放并携带巨噬细胞迁移抑制因子进入细胞核，最终剪切染色体DNA，产生15～50 kb的DNA片段，导致细胞死亡[43]。Caspase在PARP-1依赖性细胞死亡过程中被激活，且Caspase抑制剂并不能阻止这个过程，但PARP抑制剂及沉默或敲除PARP-1可有效阻止。

研究表明HIRI可以激活PARP-1依赖性细胞死亡通路。PARP-1是肝脏炎症反应的关键介质，HIRI可显著诱导PARP-1上调并募集中性粒细胞至肝脏，促使炎症反应的发生[44]。但目前PARP-1依赖性细胞死亡的调控机制以及下游机制尚不明确，PARP-1激活是如何诱导线粒体释放AIF尚不清楚。抑制PARP-1依赖性细胞死亡可减轻HIRI。应用PARP-1抑制剂5-氨基异喹啉酮可减少中性粒细胞浸润，减少血管细胞黏附分子的表达，保存内皮完整性；特异性敲除PARP-1可使肝脏免受LPS诱导的休克及缺血性损伤[44]。明确PARP-1依赖性细胞死亡具体机制及上游调控机制，将会为HIRI提供新的研究思路和治疗策略。

7 结 语

HIRI是影响患者肝脏外科手术后肝功能及生存率的重要因素，程序性细胞死亡是HIRI的重要特征之一，新型细胞死亡形式的发现极大地提高了我们对于HIRI病理生理学的理解。在缺血-再灌注期间，程序性细胞死亡可以呈现出不同的作用，不同的细胞死亡方式在HIRI中相互调控的关系需要进一步探索。溶酶体细胞死亡、NETotic cell death、Entotic cell death等新型细胞死亡形式在HIRI中的作用也尚未见报道，亟待进一步的研究。现今各种细胞死亡的抑制剂已经进入临床试验，然而使用时仍需解决许多问题。但是随着研究的不断深入，各种类型的细胞死亡的抑制剂可能会进一步发展，并普及运用到临床当中，减少HIRI，提高肝移植成功率，改善受者预后。