瞬时受体电位阳离子通道蛋白6在缺血-再灌注损伤中的作用研究进展

郭文文 袁圆 魏华锋 罗豪 李灵玉 吕兴华

缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血组织或器官血液供应恢复导致的再灌注损伤，其特点是发生氧化应激、炎症和细胞凋亡[1]。在器官移植、创伤性休克、外科手术、血栓等发生血液循环障碍时，均会出现IRI，严重时可引起多器官功能障碍综合征，病死率极高。缺血和随后的再灌注引起受影响组织器官的各种代谢改变，缺血期影响细胞三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平和细胞内pH值，通过损害ATP酶依赖的离子运输，导致细胞内和线粒体钙水平增加（Ca2+超载）。ATP的缺乏也会破坏细胞调节机制，导致细胞器和质膜的裂解。尽管再灌注是挽救缺血组织所必需的，但会加速活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，导致促炎细胞的形成、内质网应激、细胞内离子和pH稳态的改变，进一步加重组织损伤[2]。

瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（transient receptor potential canonical，TRPC）6是一种受体激活的非选择性阳离子通道，在整个中枢神经系统和外周组织中均有表达[3]。已有研究表明TRPC6是IRI发病机制中上调的差异表达基因，提示其可能是治疗IRI的新靶点[4]。因此，本文对TRPC6在IRI中的研究进展做一简要总结，以期为改善器官移植过程中IRI提供参考。

1 TRPC6的概述及功能

瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道是一组主要位于多种细胞质膜上的离子通道，对阳离子具有较大的非选择性渗透[5]。哺乳动物TRP通道家族共有28个成员，分为6个亚家族：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP和TRPV，彼此之间具有一定的结构相似性[6]。TRP通道是感觉信号的重要媒介，对细胞功能和信号通路有显著影响。编码TRP通道的基因突变是导致人类几种遗传性疾病（TRP通道病）的原因，这些疾病影响心血管、肾脏、骨骼和神经系统[6]。TRPC是TRP家族中一组由受体控制的Ca2+渗透非选择性阳离子通道。哺乳动物TRPC的7个成员，根据其氨基酸序列和功能相似性，可进一步分为4个亚群（TRPC1、TRPC2、TRPC4/5和TRPC3/6/7），具有广泛的细胞功能和生理作用[7]。其中TRPC6在胎盘、心脏、肺、胰腺、肾脏、神经系统和大脑的许多区域高度表达[2]，通过调节细胞内游离Ca2+，参与调节氧化应激，跨内皮细胞迁移、趋化、吞噬和细胞因子释放的免疫应答[8-9]。

2 TRPC6与缺血-再灌注损伤

2.1 TRPC6与肾缺血-再灌注损伤

肾IRI是一种以肾功能受损为特征的严重综合征，与慢性肾病的高发生率相关，并可能发展为终末期肾病，导致多器官衰竭而增加病死率[10]。已有研究表明，氧化应激、Ca2+超载和线粒体功能障碍是IRI期间细胞损伤和凋亡的关键因素。因此，减轻Ca2+超载诱导的细胞凋亡，可促进肾小管上皮细胞完整性和功能的恢复[11]。TRPC6是一种非选择性Ca2+通道，是维持正常肾功能的重要蛋白，对肾IRI有保护作用[12-13]。

Hou等[14]研究发现肾IRI后TRPC6表达增加，导致Ca2+过度内流，减轻肾小管上皮细胞的保护性自噬，从而增加IRI作用下的细胞凋亡。TRPC6敲除增强了自噬水平，减轻了线粒体功能障碍和细胞凋亡，显著降低蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和细胞外调节蛋白激酶（extracelluar regulated protein kinase，ERK）1/2的磷酸化水平。这些发现提示敲除TRPC6可通过降低Ca2+超载，参与下调磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt和 ERK信号，显著改善肾IRI。Shen等[13]研究结果显示，肾IRI后HK-2细胞的凋亡和坏死明显增加，TRPC6表达显著上调，诱导受体相互作用蛋白（receptorinteracting protein，RIP）1、多聚二磷酸腺苷核糖聚合 酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）-1和沉默信息调节因子（sirtuin）-2蛋白的表达，用坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1（Nec-1）治疗后，可以显著抑制IRI诱导的细胞坏死性凋亡。而敲除TRPC6进一步增强了IRI诱导的RIP1表达上调，逆转了IRI诱导的PARP-1的表达，但对IRI后sirtuin-2的表达没有影响，表明TRPC6参与了IRI后的坏死性凋亡。进一步使用TRPC6激动剂OAG后，显著减轻了IRI后坏死性凋亡，然而使用TRPC6抑制剂SKF96365后，细胞坏死性凋亡加重，提示TRPC6可能通过阻断肾IRI诱导的坏死性凋亡，在肾IRI中发挥保护作用。该课题组进一步研究发现TRPC6为微小核糖核酸（microRNA，miR）-26a的直接靶基因，miR-26a不仅与缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-α作用形成正反馈环，而且还直接抑制TRPC6活性，首次证明Nec-1可通过抑制坏死性凋亡、氧化应激和炎症等途径有效保护肾IRI，并可能是通过HIF-1α/miR-26a/TRPC6/PARP-1信号通路发挥作用[15]。

2.2 TRPC6与心肌缺血-再灌注损伤

心肌IRI在急性心肌梗死、心脏骤停、经皮冠状动脉介入治疗和心脏手术中较常见，其病死率较高。在心肌IRI过程中，线粒体中Ca2+积累可导致线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的激活。mPTP激活后，线粒体迅速膨胀并释放凋亡和坏死因子，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid protease，Caspase）依赖性和非依赖性的细胞死亡，从而引起心肌功能障碍。因此，减少Ca2+进入，切断Ca2+超载是减轻心肌IRI的一种有效方法[16]。已有研究表明，使用SKF96365或敲除TRPC6可以保护心肌H9c2细胞免受缺氧-复氧损伤[17]。

Yang等[18]研究发现，七氟醚预处理可上调间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）中的TRPC6、HIF-1α、CXC趋化因子受体（CXC chemokine receptor，CXCR）4和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，以及缺氧-复氧条件下MSC中VEGF的释放，通过小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）敲除TRPC6可逆转这一过程。此外，与缺氧-复氧组比较，MSC移植组和七氟醚预处理的MSC移植组小鼠再灌注后3 d左心室射血分数、左心室短轴缩短率明显改善，梗死面积减小，血清乳酸脱氢酶、心肌肌钙蛋白I水平降低，血清白细胞介素（interleukin，IL）-10水平显著升高，IL-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平显著降低，表明七氟醚预处理通过激活TRPC6调节的HIF-1α/CXCR4/VEGF轴，促进MSC诱导的血管生成，改善损伤小鼠左心室收缩功能，减轻心肌梗死和炎症，增强对心肌IRI的保护作用。Ramez等[19]研究发现，即使是短期的有氧运动训练也可以显著提高血浆Klotho水平，而Klotho是一种抗衰老蛋白，可抑制心肌IRI过程中TRPC6的表达，减小梗死面积，保护心脏免受IRI，可作为治疗和预防心肌IRI的靶点。

2.3 TRPC6与脑缺血-再灌注损伤

脑IRI是指缺血性脑卒中患者缺血区域恢复血流后并不能恢复缺血区组织功能，反而加重了缺血区损伤和功能障碍的现象，具有发生率高、致残率高、病死率高的特点[20]。Ca2+超载是脑IRI的关键因素，大量Ca2+内流可导致线粒体功能障碍和ROS的产生，破坏细胞结构，诱导自由基生成，最终导致氧化应激和神经元凋亡[21]。越来越多的证据表明，TRPC6在脑IRI中发挥重要作用[22]。TRPC6作为Ca2+内流的调节因子，参与神经元存活、突触形成、神经元生长引导和感觉传导[23]。增加TRPC6的表达可保护缺血神经元，抑制TRPC6的表达可诱导神经元凋亡，因此TRPC6已成为缺血性脑卒中潜在的治疗靶点[21]。

Liu等[24]研究了TRPC6在氧糖剥夺细胞模型和大脑中动脉闭塞小鼠脑卒中模型中的作用，发现在IRI时TRPC6显著下调，HYP99（选择性TRPC6激动剂）可减轻缺血后小鼠脑梗死病变、减少星形细胞凋亡及皮质中IL-6和IL-1β的释放，而SKF96365则加重了损伤。此外，TRPC6的过表达降低了IRI诱导的Ca2+进入星形胶质细胞，减轻星形胶质细胞的凋亡、细胞毒性、炎症反应和核因子（nuclear factor，NF）-κB磷酸化，表明TRPC6可作为一个潜在的靶点，在IRI中降低星形胶质细胞的炎症反应和凋亡，进而减轻缺血性脑损伤。Wang等[25]通过建立大鼠中动脉闭塞IRI模型和皮层神经元氧糖剥夺模型，探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）联合奥拉西坦治疗急性脑IRI的疗效，发现联合治疗组TRPC6表达增加，神经元细胞死亡减少，梗死面积缩小，缺血脑组织的功能恢复显著改善，提示TRPC6在BMSC和奥拉西坦联合治疗中发挥重要作用。进一步研究发现BMSC在TRPC6通路的激活中发挥作用，奥拉西坦可以通过抑制TRPC6降解来保护TRPC6神经元存活通路的完整性，表明TRPC6神经元存活通路在BMSC联合奥拉西坦治疗急性脑IRI的保护作用中发挥了重要作用。

2.4 TRPC6与肺缺血-再灌注损伤

肺IRI在肺移植、急性肺栓塞术后较常见，常引起急性肺损伤，可导致死亡。肺IRI通常导致微血管内皮的大规模损伤、肺水肿和严重的器官功能障碍，其与氧化应激、Ca2+超载、炎症反应等有关[26]。最近的研究表明，TRPC6在肺中高表达，Ca2+通过TRPC6进入对增加内皮细胞通透性和损害肺血管屏障功能至关重要[27]。

Weissmann等[28]研究发现，TRPC6是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）2产生ROS的一个靶点，OAG显著增强了野生型小鼠肺IRI后的血管通透性，TRPC6敲除小鼠肺血管内皮细胞中Ca2+的水平降低，从而保护受损肺组织。在野生型和NOX2缺陷小鼠肺IRI后，野生型小鼠肺血管通透性增强，肺重量显著增加，毛细血管过滤系数增加，而NOX2缺陷小鼠肺组织几乎完全不受影响，表明NOX2和TRPC6在小鼠肺IRI的过程中具有不可或缺的作用。另有研究发现SH045（选择性TRPC6抑制剂）能减少小鼠离体肺组织的水肿，治疗肺IRI引起的水肿[29]。因此，TRPC6可作为治疗肺IRI的一个有效靶点。

2.5 TRPC6与视网膜缺血-再灌注损伤

已有研究发现TRPC6在哺乳动物视网膜中高表达，表明TRPC6参与了视网膜正常生理功能的调节[30]。Wang等[31]研究发现TRPC6信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）和蛋白在大鼠视网膜神经节细胞层选择性富集，视网膜缺血60 min可诱导TRPC6 mRNA和蛋白升高，再灌注后24 h达到峰值。TRPC6激动剂可显著提高视网膜神经节细胞存活率，抑制剂可降低视网膜神经节细胞细胞密度。进一步研究发现，阻断TRPC6后脑源性神经营养因子前体在24 h内增加，表明TRPC6的保护作用可能是通过脑源性神经营养因子依赖途径介导的。

3 TRPC6靶向药物在IRI中的治疗前景

IRI可引起一系列严重的临床问题，目前尚无有效的解决办法。TRPC6是Ca2+可渗透的非选择性阳离子质膜通道，作为治疗IRI潜在靶点而获得了相当大的关注[22]。TRPC6是开发治疗IRI药物的一个很有前途的分子靶点，关于调节TRPC6活性的药物已有大量研究，具有巨大的临床应用潜力。

3.1 金丝桃素及其衍生物

金丝桃素是贯叶连翘的提取物，具有神经保护和抗抑郁样特性[32]。在不同的啮齿动物缺血性卒中模型中，金丝桃素已被证明能促进卒中后神经和血管生成[33]。Lin等[34]研究发现金丝桃素及其衍生物可以特异性激活TRPC6，抑制钙蛋白酶（calpain）介导的TRPC6降解，进而通过RAS/MEK/ERK和钙调蛋白/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ途径增加环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）的磷酸化，参与缺血性脑卒中后的神经保护。但是金丝桃素被认为与细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A4的诱导有关，表明它可能存在不良反应和药物间的相互作用，且其不易合成，光照不稳定，对胃肠道有刺激性，这些不良反应可能限制使用金丝桃素作为TRPC6激动剂[35]。

3.2 白藜芦醇

白藜芦醇存在于葡萄、浆果、花生和其他植物中，是具有抗氧化和免疫调节活性的天然化合物之一，被认为是TRPC6的间接正调节剂。在大鼠脑IRI模型中，白藜芦醇通过抑制钙蛋白酶活性，可显著减小脑梗死面积，发挥神经保护作用[36-37]。Li等[38]发现白藜芦醇可通过降低谷胱甘肽过氧化物酶4和铁蛋白重链1的表达，增强转铁蛋白受体1的表达，减轻氧化应激和铁死亡，减轻心肌IRI。另有研究表明白藜芦醇和槲皮素联合治疗可以减轻心脏组织损伤和减小梗死面积，发挥心脏保护作用[39]。此外白藜芦醇对腹主动脉瘤破裂IRI模型诱导的肝、肺损伤发挥保护作用[40-41]，并可通过多种途径减轻视网膜、脊髓IRI[42-43]。尽管白藜芦醇通常被认为是无毒的治疗药物，但高剂量白藜芦醇可抑制CYP3A4活性，从而抑制药物代谢清除，增加药物的生物利用度和毒性，因而在临床中应避免高剂量使用产生的不利影响[44]。

3.3 哌嗪类衍生物

Sawamura等[45]发现了一组基于哌嗪类化合物的TRPC3/6/7强效激动剂，在受体操作模式下发挥作用，对不同的通道亚型具有不同的选择性。曲美他嗪（trimetazidine）是一种哌嗪类衍生物，作为抗心绞痛药物已广泛应用于临床[46]。Chen等[47]发现曲美他嗪可通过靶向Gasdermin D（GSDMD）抑制焦亡，减轻心肌IRI。另有研究证明曲美他嗪具有抗氧化作用，通过隔离脂质过氧化发生改善肾IRI[48]。沃替西汀（vortioxetine）是治疗抑郁症的新药，是小分子哌嗪类硫化物，Emam等[49]首次证实了沃替西汀是一种有效的神经保护剂，可通过抑制氧化应激、细胞凋亡、炎症反应和内质网应激减轻脑IRI。阿魏酸哌嗪（piperazine ferulate）目前已用于各类伴有镜下血尿和高凝状态的肾小球疾病，以及冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、脉管炎等的辅助治疗。Lei等[50]发现阿魏酸哌嗪可通过抑制NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体活化和焦亡，减轻大鼠心肌IRI。然而哌嗪类衍生物作为大多数TRPC6激动剂，可与TRPC3和TRPC7发生交叉反应，限制了它们作为特异性TRPC6调节剂的使用[45]。

此外几种内源性物质如甘油二酯、溶血磷脂酰胆碱和花生四烯酸的代谢物20-羟-二十烷四烯酸已被证实可激活TRPC6，然而它们对IRI的作用及机制仍需进一步研究[35]。TRPC6在结构上与TRPC3和TRPC7相似，因此大多数化合物不能选择性地作用于这3种异构体中的任何一种，这使得开发高选择性和特异性TRPC6新型药物变得困难。此外，一些TRPC6调节剂对其他细胞靶点具有交叉反应性，也限制了它们的应用[35]。

4 小结与展望

综上所述，TRPC6在机体各个组织器官中均表达，在维持细胞正常生物学功能中发挥重要作用，以TRPC6为靶点的化合物可能具有作为预防和治疗IRI的新型药物的临床潜力。然而TRPC6在人体组织中广泛分布，应用TRPC6的激动剂和拮抗剂可能会带来一些系统性的不良反应。因此，在研究开发以TRPC6为靶点的新型药物之前，需要充分考虑上述因素。目前关于TRPC6在IRI中的研究取得了很大进展，然而有关TRPC6在IRI中的调节作用和确切机制仍有待进一步研究，以实现基础研究向临床研究转化，为IRI的靶向治疗提供新的思路。