miR-155在器官移植排斥反应中的作用研究进展

张阳 杨金伟 李兴德 马雪娇 张函舒 宋沧桑

目前，器官移植是治疗终末期疾病的有效手段。虽然近几年来免疫抑制药的研发以及免疫疗法的创新使得移植器官存活率得到了一定的提升，但是器官移植术后所产生的排斥反应仍然是导致移植器官功能异常甚至失功的主要因素之一。排斥反应的发生机制至今尚未完全清楚，因此，深入研究器官移植排斥反应的相关分子机制对克服这一难题具有重要意义。

近年来，微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）因其在细胞生物学活动中发挥的调控作用逐渐成为研究热点，其异常表达与人类多种疾病的发生、发展及预后密切相关，如癌症、免疫系统疾病等[1-2]。miR-155作为近年来被广泛研究的miRNA，被发现具有强大的免疫调节功能，因而被器官移植领域所关注[3]。随着相关研究的不断深入，发现miR-155表达水平和功能状态可能与排斥反应的发生密切相关，可能成为克服机体排斥反应的新靶点。因此，本文通过总结miR-155与免疫调节相关研究来进一步阐述miR-155在器官移植排斥反应的作用，进而为miRNA作为器官移植的治疗靶点提供新的思路。

1 miR-155的结构特点

成熟的miR-155是由大约20 个碱基所构成的单链非编码RNA。参与其编码的宿主基因为位于人类21号染色体的MIRHG155，该基因最初也被称为B细胞非编码基因簇（B-cell integration cluster，BIC），由3个外显子构成，在其第3个外显子中含有约1 500 bp的初级miR-155转录本，最终合成成熟的miR-155。成熟的miR-155具有两种形式即miR-155-5p和miR-155-3p，由于miR-155-5p是主要的生物活性形式，因此大多数的研究主要集中在miR-155-5p。miR-155转录本在细胞核内先由RNA聚合酶生成初级miR-155 （pri-miR-155），而后经核酸内切酶3（Drosha）剪切后形成发卡样结构的前体miR-155（pre-miR-155），之后由出核因子Exportin 5将前体miR-155输出到细胞质中，在细胞质中前体miR-155进一步被另一种核酸内切酶Dicer加工成约20个碱基的双链RNA。其中miR-155-5p整合到RNA诱导的沉默复合体中，引导沉默复合体与其靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）结合，miR-155-3p则被降解。

2 miR-155的生物学特性

miR-155主要以5’端的种子序列（6～8个碱基）通过不完全的碱基互补配对方式与靶mRNA的3’端非翻译区（3’-untranslated region，3’UTR）结合，从而抑制靶mRNA的蛋白编码功能或直接导致其降解，即在转录后翻译水平抑制靶基因的表达来实现自身的生物学特性。由于miR-155功能行使的特殊性，也就决定了其能够调控多种基因的表达，从而调控体内多种生命进程如细胞分化增殖、信号传导以及免疫应答等。

2.1 稳定性

有学者已经证实内源性血浆miRNA在血浆样本中性质稳定，分别在室温和冻融循环的条件下仍能维持活性，对核糖核酸酶具有抗性，这可能是由于miRNA在细胞内合成后通过外泌体、微泡、凋亡小体等多种途径跨膜运输到细胞外，其外膜结构对内部的miRNA分子产生了保护效应[4]。

2.2 易于被检测

在人体多种体液中的miR-155均能够被定量检测，其中在移植领域中可采用的检测样本包括移植物组织、血浆、尿液以及外周血单核细胞等[5]。其中血液具有易获得性、保存方便以及非侵入性等优势，通常作为临床试验检测样本的首选。目前检测miR-155的方法主要包括逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、Northern印迹杂交和原位杂交技术。

3 miR-155对器官移植排斥反应的免疫调控

排斥反应是复杂的免疫现象，机体的固有免疫应答和特异性免疫应答协同参与了移植排斥反应。在受者接受移植后，最先引发的是机体的固有免疫应答，引起供体的炎症反应，因此导致组织损伤，进而诱导特异性免疫应答。miR-155在活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）中高度表达[6-8]。同时，miR-155在人体内参与多种免疫调控路径，包括炎症介质的调控、CD4+T细胞的分化、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和CD8+T细胞的功能以及B细胞的分化和抗体的形成[9]。由此可见，miR-155在免疫细胞发育和免疫应答中起着关键作用。

3.1 miR-155对固有免疫的调节作用

固有免疫是机体在出生后已拥有的非特异性防御功能，巨噬细胞是固有免疫中的主要效应细胞，其在器官移植排斥反应的启动和效应阶段中都发挥着极其关键的作用。巨噬细胞参加固有免疫应答的方式包括吞噬病原体、释放炎症因子、辅助其他的免疫细胞等。miR-155对炎症的发展具有促进作用，有研究报道，Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）作为固有免疫系统受体之一, 在启动细胞固有免疫应答中发挥重要的作用，miR-155能够激活TLR家族成员，如TLR4的活性[10]，从而发挥促进炎症发展的作用，并且已经有研究证实敲除巨噬细胞的miR-155能够诱导其对TLR相关配体低反应性的产生[11]。另一方面，miR-155能够抑制细胞因子信号传导抑制蛋白 1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）、SH2肌醇聚磷酸酯-5-磷酸酶（SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase，SHIP1）等负调控因子的表达而发挥调控炎症发展的作用[12-14]。另外，miR-155能够促进巨噬细胞抗原提呈作用，Li等[15]通过体外实验发现，miR-155能够通过抑制SOCS1的表达，增强枯否细胞的抗原提呈作用，增加主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ和共刺激分子的表达，并通过Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号传导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路诱导促炎的辅助性T细胞（helper T cell，Th）1相关细胞因子干扰素（interferon，IFN）-γ的表达。有研究表明miR-155能够调控巨噬细胞M2极化，而M2型巨噬细胞在诱导器官移植术后免疫耐受中具有重要作用。Teng等[16]发现在细胞内传递anti-miR-155能够将巨噬细胞极化为M2表型，并抑制炎症的发生。Li等[17]也同样发现敲除miR-155能够诱导M2型巨噬细胞标志物表达增高，一氧化氮合酶（M1型巨噬细胞标志物）表达降低。

DC是固有免疫和特异性免疫的桥梁细胞，能摄取、加工、提呈抗原，启动T细胞介导的免疫应答。有研究表明在人源单核细胞来源的DC成熟过程中，miR-155水平显著提高，下调转录因子脾病灶形成病毒整合位点原癌基因（spleen focus forming virus proviral integration oncogene 1，SPI1）（PU.1）的表达并减少DC细胞表面2型跨膜凝集素受体的水平[18]。Van Aelst等[19]通过对小鼠心脏移植模型进行研究发现，miR-155对SPI1具有抑制作用，可能通过抑制SPI1的RNA翻译过程从而促进DC向T细胞提呈抗原，并促进白细胞介素（interleukin，IL）-6的信号传导。miR-155可直接控制重要的信号传导分子转化生长因子-β-活化激酶 1 结合蛋白 2（transforming growth factor-β-activated kinase 1-binding protein 2，TAB2）的水平。有研究证明，在成熟的人类DC中，miR-155靶向TAB2 的3’UTR，因此可能在DC激活的晚期对TLR/IL-1信号通路施加负反馈控制，从而抑制了 IL-1β的产生以及DC的自分泌功能[20]。

3.2 miR-155对特异性免疫的调节作用

T细胞介导的细胞免疫在整个排斥反应中发挥着关键作用，急性排斥反应与T细胞介导的免疫效应密切相关。CD4+T细胞和CD8+T细胞所介导的排斥反应是T细胞参与的器官移植排斥反应的主要类型。CD4+T细胞参与器官移植排斥反应的细胞亚群主要包含Th1、Th2、Th17和Treg 4种，目前大部分关于器官移植的基础实验研究主要发现miR-155表达影响T细胞分化的亚型主要为Th1、Th17。Zhang等[21]发现，在miR-155敲除小鼠的慢性排斥反应模型中IFN-γ、IL-17A和Foxp3表达水平降低，Th1、Th17表现出低活性。同时该研究还进一步发现，对CD4+T细胞进行miR-155敲除后，导致Th17极化特征的缺失，miR-155通过抑制Th17的SOCS1和转录因子c-Maf表达，从而调控Th17的分化[21]。CD8+T细胞也称为细胞毒T细胞，在器官移植排斥反应中其活化后介导的移植物损害也日益成为器官移植领域关注的焦点。有研究发现，在小鼠的移植物抗宿主反应中miR-155敲除后导致CD8+T细胞的增殖活性减弱[22]。但由于目前对于器官移植排斥反应中miR-155与CD8+T细胞相关调控机制的研究仍比较缺乏，尚需更多实验予以验证。

恒定自然杀伤T细胞（invariant natural killer T cell，iNKT）是T细胞的一个独特亚群，同时具备自然杀伤细胞和T细胞特征。在特异性免疫中，由于其具有相对恒定的T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR），因此其在外来抗原的刺激下活化后能够产生大量的Th1和Th2相关的细胞因子，从而调控Th1/Th2分化以及调节其他免疫细胞的功能。近来研究发现，miR-155作为一个关键的表观遗传调节因子，可协调多种信号通路和转录程序，精确调节iNKT发育和功能谱系，上调miR-155会导致iNKT发育中断[23]。

Treg在控制免疫反应和介导免疫耐受中具有非常重要的作用。miR-155对Treg的功能具有调节作用。有研究报道，通过抑制miR-155和蛋白prenylation所构成的反馈环从而调节Th17和Treg之间的平衡能够减轻急性移植物抗宿主病[6]。研究表明miR-155对Treg具有调控作用，小鼠心脏移植后注射间充质干细胞可以逆转miR-155表达的增高，从而导致Th1/Th2平衡改变和Treg表达上调[24]，表明miR-155极有可能参与了对Treg分化的调控从而介导排斥反应的发生。

B细胞作为体液免疫中最为重要的淋巴细胞，同样也在器官移植排斥反应中发挥着重要的作用。先前的研究报道，miR-155在B细胞活化时通过作用于PU.1，使得转录因子Pax5表达下调，从而使得浆细胞形成受到抑制[25]。Arbore 等[9]进一步证实了miR-155可以通过调节B细胞、浆母细胞的存活和增殖，从而控制抗体的产生，调节抗体转化，进而控制滤泡外免疫反应的程度。另外miR-155可能通过影响SHIP、活化诱导型胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine decminase，AID）等靶点来介导B细胞的增殖与活性[26-27]，其具体机制还需进一步研究来阐明。

4 miR-155在器官移植排斥反应中的应用前景

移植物活组织检查（活检）一直作为临床诊断移植排斥反应的金标准，但其作为一种侵入性的诊断方法存在手术意外风险高、可重复性差和抽样误差等问题，并不适用于实时监测早期移植排斥反应的发生。而miR-155具有稳定性、易于被检测的特性以及免疫特性决定了其作为移植排斥反应潜在的生物标志物的可能。许多研究都认为miR-155对于诊断及预测移植术后排斥反应发生均具有较高的特异度和灵敏度[28-31]。在近5年的临床研究中，已经发现miR-155在肾、肝、心脏和肺移植等不同器官移植受者中，其表达水平与移植排斥反应的发生有着紧密的联系[28-29,30-35]。Soltaninejad等[36]通过对肾移植排斥反应与非排斥反应患者的移植物活检样本以及外周血单核细胞的miR-155表达水平进行比较发现，排斥反应患者活检样本的miR-155表达水平均较非排斥反应患者升高，同时该研究的受试者工作特征曲线分析也表明，通过利用移植物活检样本中的miR-155表达水平可以预测排斥反应的发生。有研究对可能介导排斥反应的器官特异性和跨器官生物标志物进行了系统评价，表明在移植受者的排斥反应中，miR-155是表达增加的生物标志物[37]。miR-155作为一种非侵入性的生物标志物对于器官移植排斥反应的诊断相关研究意义重大。

虽然已知循环体液中的miRNA有望成为器官移植排斥反应中的新型生物标志物，但在临床中的应用仍然具有不确定性。首先，目前多数研究都是基于小规模样本以及病例对照研究设计，缺乏大规模的临床实践；其次，虽然miRNA的提取以及定量技术目前已经很便利，但是目前提取、定量等相关的实验方法和内参基因均未制定统一的标准，因而使得不同机构的检测结果不具备可比性，因此虽然miR-155具有非常高的应用潜力，但目前还不能将其视为马上能应用于器官移植排斥反应的诊断工具，而且即使在临床诊断时，还需要多种特异性的miRNA联合应用以提高灵敏度和特异度。

5 小结与展望

综上所述，miR-155在器官移植排斥反应的发生和发展中扮演了极其重要的角色。miR-155作为一个参与先天性免疫和获得性免疫的重要miRNA分子，其在器官移植术后介导免疫细胞分化、相关细胞因子的调控等作用已经被越来越多的研究所证实。随着对miR-155在器官移植排斥反应中的作用研究逐步深入，其参与器官移植排斥反应的免疫调控机制将逐步阐明，相信在不久的将来miR-155有望成为用于临床诊断排斥反应和药物治疗的新靶点，为新型免疫抑制药开发和排斥反应治疗提供新思路。