基于重复测量方差分析观察黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗糖尿病肾脏病Ⅲ期的临床疗效

王文文 林永强 王超超 姜 益

温州市中西医结合医院肾内科,325000 浙江 温州

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，是导致糖尿病患者进展至终末肾衰竭的重要病因[1]。Mogensen根据临床与病理过程将DKD分为5期，其中Ⅲ期患者早期的肾组织损伤可反映在临床样本中，而且能够被药物所改善，是临床介入的关键阶段[2-4]。氯沙坦等血管紧张素受体拮抗剂(ARB)以及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)是临床干预Ⅲ期DKD的基础药物，其能够保护残余肾功能[4-5]。近年来，黄蜀葵花提取物研制的中成药制剂——黄葵胶囊，也被临床证实能够改善DKD导致的病理损伤。多项研究结果表明黄葵胶囊联合ARB或ACEI治疗晚期DKD在疗效方面优于单用ARB或ACEI治疗[6-8]。然而黄葵胶囊联合ARB或ACEI治疗Ⅲ期DKD的疗效如何，目前鲜有研究报道。此外，这些研究均只设置单一观察节点，未能全面体现黄葵胶囊在治疗早期DKD的疗效特点，所得结果较为片面。重复测量数据的分析方法可充分利用各时间节点数据，考虑研究指标随时间变化的趋势及其之间可能存在的交互效应，结果更为全面客观[9-10]。本研究采用重复测量方差分析的统计方法，探讨黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗Ⅲ期DKD的临床疗效，为其进一步临床应用提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年1月至2021年12月于温州市某中西医结合医院肾内科进行治疗且符合本研究纳入标准的Ⅲ期DKD患者作为研究对象。本研究经温州市中西医结合医院伦理委员会审查通过(2019-K002)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准

DKD的诊断标准参照《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南》[11]拟定的在明确糖尿病作为肾损害的病因且排除其他原因导致慢性肾脏病的情况下，出现以下任意1条即可诊断：

(1)排除干扰因素后，在3～6个月进行的3次检测中至少2次尿白蛋白/肌酐比值≥30 mg/g或尿蛋白排泄率≥30 mg/24 h；

(2)估算的肾小球滤过率<60 ml·min-1·(1.73 m2)-1；

(3)经肾活检证实为DKD。DKD分期依据国际通用的Mogensen标准[12]：Ⅲ期即持续性微量白蛋白尿期，尿常规检查可正常，尿蛋白定量小于0.5 g/d，尿蛋白排泄率30～300 mg/24 h，肾小球正常或接近正常，病变仍为可逆性。

1.3 病例选择标准

1.3.1 纳入标准

(1)符合上述诊断标准的DKD Ⅲ期患者；

(2)年龄≥18且≤75岁；

(3)患者意识清楚、依从性好且自愿签署知情同意书。

1.3.2 排除标准

(1)哺乳期及妊娠期妇女；

(2)合并有严重心血管系统、消化系统及血液系统并发症者；

(3)合并肉眼或镜下血尿者；

(4)合并严重高血糖、酮症酸中毒、高渗性昏迷者；

(5)基础资料不全者。

1.3.3 剔除、脱落标准

(1)实施过程中发现存在不符合本研究纳入标准者；

(2)因各种其他原因退出本研究者。

1.3.4 终止试验标准：

(1)研究过程中发现病情急剧加重者；

(2)因严重不良反应自行退出本研究者。

1.4 分组方法

使用随机数字表生成随机分配序列。拟定随机化方案，随机化分配方法由一名不直接参加研究对象纳入和干预的人员执行。合格病例进入试验后，通过打开预先准备的密封随机分组信封进行随机分组，分为试验组(黄葵胶囊联合氯沙坦钾)和对照组(氯沙坦钾)。

1.5 干预措施

纳入本研究的患者均接受相同的基础治疗，包括接受自主糖尿病饮食+口服降糖药(糖适平+拜糖苹，常规剂量和用法，使血糖平均值保持在正常范围以内)。

1.5.1 对照组

在基础降糖治疗基础上给予氯沙坦钾片(杭州默沙东制药有限公司)，100 mg/次，1次/d，饭后30 min口服，连续治疗12周。

1.5.2 试验组

在对照组的基础上加用黄葵胶囊(江苏苏中药业集团股份有限公司)，2.0 g/次，3 次/d，饭后30 min口服，连续治疗12周。

1.6 疗效指标和观察时点

1.6.1 主要疗效指标和观察时点

主要疗效指标包括24 h尿微量白蛋白定量(24 h urinary protein，Upro)、尿肾损伤分子-1(urinary kidney injury molecule-1，UKim-1)及尿β2-微球蛋白(urinary β2-microglobulin, Uβ2-MG)。观察时点：治疗前、治疗后4周、治疗后8周及治疗后12周分别测量上述指标。

1.6.2 次要疗效指标和观察时点

次要疗效指标为中医临床证候积分。以中华中医药学会肾病分会颁布的《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》[13]为依据，与DKD III期患者相关的中医证候主要包括小便频数或清长，或浑浊如脂膏，纳呆，倦怠乏力;面色苍白，腰膝酸软，或尿少，肢体浮肿；脘腹胀满，纳呆恶心；渴不多饮，口有秽臭，肢体重着，头重如裹；舌淡胖、苔黄腻，脉滑数等。根据患者的临床证候，按重、中、轻、无等级别，分别记3、2、1、0分。观察时点：治疗前及治疗后12周测量该指标。

1.7 样本量计算

本研究为基于重复测量方差分析的随机对照试验，试验组为黄葵胶囊联合氯沙坦钾片组，对照组为氯沙坦钾片组，样本量计算以UKim-1在2组间的改善差值是否有统计学差异为依据。通过查阅文献，初次重测相关系数设为0.7，递减率为0.5，设双侧α=0.05，把握度为80%。按照GLIMMPSE网站(https://glimmpse.samplesizeshop.org/)提供的计算公式进行计算，得到试验组的样本量N1=33例，对照组的样本量N2=33例，按20%失访计算，最终需纳入80例研究对象。

1.8 统计学方法

数据采用SPSS 25.0统计软件进行分析。通过箱线图判断数据异常值，通过Shapiro-Wilk检验判断数据分布情况。符合正态分布的连续性变量用均数和标准差表示，2组间进行独立t检验；不符合正态分布的连续性变量用中位数和四分位间距表示，并对2组间进行Mann-WhitneyU检验；分类变量以频率和构成比表示，组间采用卡方检验。对符合正态分布且满足方差齐性的重复测量疗效指标进行分析，若满足Mauchly′s球形假设检验则采用两因素方差分析，若不符合球形假设检验，则行Greenhouse-Geisser法校正。在重复测量方差分析结果中，若时间与处理因素之间不存在交互效应，则直接采用主效应检验来评价处理因素的效应；若时间与处理因素之间存在交互效应，则应当分析单独效应，即通过单因素重复测量方差分析组内效应，通过多变量方差分析组间效应。采用Bonferroni方法对检验水准α=0.05进行校正后进行两两比较。

2结果

2.1 患者基线资料

共纳入86例DKDⅢ期患者，试验组和对照组各43例。试验组与对照组基线资料的各项指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明2组患者具有可比性。见表1。

表1 2组患者基线资料比较

2.2 Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平的主效应检验

对2组患者治疗期间在不同时间点的Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平进行正态性和方差齐性检验，结果显示2组患者的Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平均服从正态分布且方差齐(P>0.05)。Mauchly′s球形假设检验表明因变量Upro、UKim-1、Uβ2-MG的方差协方差矩阵均相等(χ2=3.237,P=0.664；χ2=5.285,P=0.382；χ2=8.455,P=0.133)，故结果无需经Greenhouse-Geisser法校正。

分析2组患者治疗期间Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平的结果显示：时间效应有统计学意义(F=582.825,P<0.001；F=124.876,P<0.001；F=435.119,P<0.001)，这表明2组患者治疗期间Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平随时间而改变；2组患者Upro和Uβ2-MG水平组间效应差异有统计学意义(F=151.359，P<0.001;F=84.378，P<0.001)，这表明试验组和对照组的Upro、Uβ2-MG水平存在差异，但2组间UKim-1水平组间效应无统计学意义(F=1.246，P=0.271)；2组患者Upro和Uβ2-MG水平交互效应差异具有统计学意义(F=130.046，P=0.003;F=69.489，P<0.001)，说明时间因素对Upro和Uβ2-MG水平的影响随着治疗方法不同而有所不同。因此，2组患者时间效应和组间效应进行单独效应的检验。见表2和图1、图2、图3。

图3 2组患者不同时点Uβ2-MG水平和组别交互作用

表2 2组患者治疗期间Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平的重复测量方差分析

图1 2组患者不同时点Upro水平和组别交互作用

图2 2组患者不同时点UKim-1水平和组别交互作用

2.3 Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平的单独效应检验

采用单因素重复测量方差分析方法，判断黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗12周对Ⅲ期DKD患者的Upro以及Uβ2-MG的影响，结果显示：与治疗前比较，2组患者治疗后的Upro以及Uβ2-MG水平均有上升(F=295.533，P<0.001；F=141.490，P<0.001)。

采用Bonferroni方法对检验水准α=0.05进行校正(α′=0.008)后，试验组不同时间Upro水平比较结果为治疗前>治疗后4周>治疗后8周>治疗后12周(P<α′)；对照组不同时间Upro水平比较结果为治疗前>治疗后4周>治疗后8周(P<α′)，但治疗后8周与治疗后12周的Upro水平差异无统计学意义(P>α′)。在Uβ2-MG指标方面，试验组不同时间Uβ2-MG水平比较结果为治疗后4周>治疗后8周>治疗后12周(P<α′)，但治疗前与治疗后4周的Uβ2-MG水平差异无统计学意义(P>α′)；对照组不同时间Uβ2-MG水平比较结果为治疗后8周>治疗后12周(P<α′)，但治疗前与治疗后4周、治疗后4周与治疗后8周的Uβ2-MG水平差异无统计学意义(P>α′)。见表3。

多变量方差分析结果显示：试验组治疗后4周、治疗后8周及治疗后12周的Upro水平均低于对照组(F=19.132，P<0.001;F=113.555，P<0.001;F=319.406，P<0.001)；试验组治疗后8周以及治疗后12周的Uβ2-MG水平低于对照组(F=100.073，P<0.001;F=232.344，P<0.001)，但治疗后4周试验组与对照组差异无统计学意义(F=0.189，P=0.665)。见表3。

表3 2组患者治疗期间血清Upro和Uβ2-MG水平比较

2.4 中医临床证候积分比较

试验组治疗后中医临床证候积分较治疗前下降(t=13.256，P<0.001)，对照组呈相同下降趋势(t=6.369，P<0.001)；治疗12周后试验组中医临床证候积分低于对照组(t=-4.080，P<0.001)。见表4。

表4 2组患者治疗前后中医临床证候积分比较

3 讨论

对于III期DKD患者而言，其早期的肾组织损伤不仅可以通过各种“肾损伤标记物”的变化特征反映在临床标本中，而且能够被药物所改善，这些药物除血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等外，还有中药复方和单味中药制剂[4,8]。因此，针对III期DKD患者肾损伤标记物而建立具有我国自身特色的中医临床治疗技术，对于防治DKD具有重要意义。

在既往有关DKD疗效的临床研究中，绝大部分都只采用t检验、方差分析或者卡方检验等经典统计方法进行分析[14-15]。上述这些统计方法均需观测值满足相互独立要求，无法分析同一个体在不同时间点上测量数据间的内部联系。重复测量的分析方法作为对经典统计方法的一种补充，可以充分利用各时间节点数据，考虑研究指标随时间变化的趋势及其之间可能存在的交互效应[9-10]。为真实反映各测量指标随时间的变化过程，明确黄葵胶囊治疗III期DKD的疗效，本研究选择采用重复测量的方差分析方法对数据进行分析。

一项纳入11篇临床随机对照试验的meta分析表明，黄葵胶囊联合缬沙坦在降低Upro方面优于单纯应用缬沙坦治疗，但进一步亚组分析显示在12周的亚组中两者差异无统计学意义[16]。与之不同，本研究进一步证实黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗III期DKD 12周疗效，其在降低Upro水平方面依然优于单独应用氯沙坦钾治疗。这可能与以下两方面原因有关：一方面，本研究有别于其他研究，采用的是重复测量的方差分析方法，这可以减少同一个体重复测量数据导致的偏差；另外一方面，本研究中纳入的患者群体为III期DKD患者，该类患者仍处于疾病早期阶段，临床指标较容易被药物所改善。动物DKD模型结果表明，黄葵胶囊能够通过抑制肾脏中 NLRP3炎性体激活和阻断TLR/ NF-κB信号传导，从而减轻DKD模型大鼠的肾小管上皮-间质转化[17]。鉴于早期DKD病变部位在肾小管,本研究分别纳入UKim-1、Uβ2-MG等2个能够早期反映肾小管损伤程度的指标。本研究结果显示在降低Uβ2-MG水平方面，黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗III期DKD疗效优于单独应用氯沙坦钾治疗，但2组患者的UKim-1只有时间效应差异具有统计学意义，这可能与UKim-1、Uβ2-MG具有不同的特异度和敏感度有关[18-19]。除Upro、UKim-1、Uβ2-MG水平等客观检验指标外，本研究也探索了黄葵胶囊对III期DKD患者中医临床证候的影响，结果显示治疗12周后黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗组中医临床证候积分低于单独应用氯沙坦钾治疗组，这也表明黄葵胶囊能有效改善III期DKD患者主观症状。

综上所述，本研究基于重复测量的方差分析方法证实疗程为12周的黄葵胶囊联合氯沙坦钾治疗III期DKD在降低Upro、Uβ2-MG水平及中医临床证候积分方面，其疗效优于单独应用氯沙坦钾治疗。但该结果尚需通过多中心、大样本的随机双盲对照研究进一步验证，以明确其疗效。