短时黑蒜体外抗氧化活性及其多酚提取优化

李静，葛世浩，多佳 ，严欢 ，马梦亚，刘军*

1.新疆大学生命科学与技术学院（乌鲁木齐 830046）；2.中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆维吾尔自治区环境污染与生态修复重点实验室（乌鲁木齐 830011）；3.中国科学院新疆生态与地理研究所，荒漠绿洲生态建设国家工程技术研究中心（乌鲁木齐 830011）；4.中国科学院大学（北京 100049）；5.新疆医科大学公共卫生学院（乌鲁木齐 830011）；6.新疆特色功能食品营养与安全检测重点实验室，新疆分析测试研究院（乌鲁木齐 830011）

黑蒜（black garlic）是一种以鲜蒜大蒜为原料，在严格控制的高温高湿下发酵1个月至数个月得到的大蒜产品[1]。在发酵过程中，大蒜内部结构被破坏，从而促进各类物质接触发生酶促及非酶促反应如美拉德反应等[2-3]。其中的刺激性物质发生转变而使其风味更加温和，具有更好的感官特性和适口性[4]。同时生物活性物质含量急剧升高，使得黑蒜具有较强的抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等功效和更低的致敏性[5-7]，其中突出的是其抗氧化活性。多酚与黑蒜的抗氧化性密不可分[8]，它是一种具有多元酚结构的次生代谢产物，多具有较强的抗氧化性，研究表明黑蒜中的多酚具有较强的抗氧化活性，且含量是鲜蒜中的5倍以上[9-10]，但因其产量较低难以在工业中大规模应用。

黑蒜作为一种新型大蒜深加工产品，具有不同于传统大蒜产品的独特营养成分与功能，在欧美与东亚地区备受研究者与消费者青睐。传统的黑蒜生产工艺主要为发酵法，生产周期为1个月乃至数月，耗时长，成本高，产能小，使得黑蒜的推广与发展受到阻碍[11]。前期以新疆吉木萨尔白皮大蒜为原料研发出一种短时加工的富含多酚的高抗氧化性黑蒜[12]，将生产周期缩短至9 h，极大降低黑蒜的生产成本，同时保证黑蒜的风味与感官品质。试验旨在通过比较短时黑蒜与鲜蒜、市售黑蒜的总酚含量和抗氧化活性，确认短时黑蒜在抗氧化方面的生物活性及研究价值，进一步对其中的多酚提取优化，为黑蒜多酚的进一步开发与应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜（新疆维吾尔自治区昌吉自治州吉木萨尔县新地乡）；短时黑蒜（自主研制加工）；市售黑蒜（北京六必居食品有限公司）。

没食子酸（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；福林酚试剂（1 mol/L，上海源叶生物科技有限公司）；无水碳酸钠、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸（均为分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司）；三氯化铁、铁氰化钾（均为分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；3%过氧化氢（山东安捷高科消毒科技有限公司）；三氯乙酸（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；冰乙酸（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；L-抗坏血酸（分析纯，上海蓝季科技发展有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；无水乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 仪器与设备

GL-20G-II冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；Thermo Multiskan Sky全波长酶标仪（上海土森视觉科技有限公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴锅、SHA-B水浴恒温振荡器、101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；JA2003电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）；MT-V-30砾鼎超纯水仪（上海砾鼎水处理设备有限公司）；DFT-50A手提式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.3 试验条件

1.3.1 体外抗氧化活性评价

1.3.1.1 总酚含量的测定

准确称取1.25 g蒜样，加入70%乙醇研磨成浆后定容至25 mL。超声30 min后过滤取滤液备用。采用Folin-Ciocalteus法测定提取物中总酚含量[13]。

1.3.1.2 体外抗氧化活性的测定

按照郑岚等[14]的方法，测定DPPH自由基清除能力及Fe3+还原力；羟自由基清除能力采用邻二氮菲-Fe2+自氧化法（Fenton法）测定[15]。

1.3.2 短时黑蒜中多酚提取优

1.3.2.1 单因素试验

将蒜样置于恒温干燥箱中60 ℃烘干至恒重，高速粉碎机打粉后收集，于4 ℃避光保存。

取1 g短时黑蒜粉加入以一定料液比加入相应体积的乙醇溶剂，置于恒温水浴振荡器中振荡一定时间后取出，将所得溶液定容至50 mL，然后按4 000 r/min离心10 min，取上清液检测总酚含量。

分别在固定其他条件的前提下改变溶剂浓度（30%，40%，50%，60%和70%）、提取温度（30，40，50，60和70 ℃）、提取时间（5，10，15，20和25 min）和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）后检测提取液中总酚含量，评价不同因素对于多酚提取的影响。

1.3.2.2 响应面优化设计

以单因素结果为基础，利用Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验设计。自变量为A（溶剂浓度）、B（提取温度）、C（提取时间）、D（料液比），响应值为总酚含量。

表1 试验因素水平表

1.3.3 短时黑蒜多酚的纯化及抗氧化活性评价

采用响应面优化结果提取短时黑蒜粗多酚获得浸出液，使用大孔树脂D101对短时黑蒜粗多酚进一步纯化，动态吸附上样浓度1 mL/min，吸附完全后使用去离子水洗至洗脱液无色，使用70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，冻干待测。

1.3.4 统计分析

上述试验均进行3次重复试验。使用Excel 2019进行数据整理，GraphPad Prism 8.0.2进行作图与方差分析，Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计与结果分析。

2 结果与分析

2.1 短时黑蒜体外抗氧化活性评价

2.1.1 鲜蒜、短时黑蒜与市售黑蒜总酚含量比对

如图1所示，鲜蒜、市售黑蒜与短时黑蒜中的总酚含量均值分别为0.67，4.56和4.73 mg/g，短时黑蒜中的总酚含量与市售黑蒜无显著性差异（P＞0.05），且显著高于鲜蒜中总酚含量（P＜0.05），为鲜蒜中含量的7倍左右。

图1 鲜蒜、市售黑蒜与短时黑蒜总酚含量比对

2.1.2 DPPH自由基清除能力

如图2所示，随着质量浓度的升高，鲜蒜、短时黑蒜及市售黑蒜对于DPPH清除率升高，呈现良好的量效关系。其中，鲜蒜的DPPH清除水平远低于短时黑蒜和市售黑蒜，最大仅为21.64%，在高、中、低3个浓度下清除率均显著低于阳性对照（P＜0.05）。中低浓度下，短时黑蒜的DPPH清除能力显著高于市售黑蒜，清除率分别为30.65%和94.95%，分别为市售黑蒜清除率的3.73和2.93倍，且在中浓度下，短时黑蒜的清除能力与阳性对照VC无显著性差异（P＞0.05）。经计算得市售黑蒜与短时黑蒜的EC50分别为8.09和0.834 3 mg/mL。因此，可认为短时黑蒜相比市售黑蒜和鲜蒜具有更强DPPH清除能力。

图2 鲜蒜、市售黑蒜与短时黑蒜DPPH清除能力

2.1.3 羟自由基清除能力

图3为鲜蒜、短时黑蒜及市售黑蒜对羟自由基清除率。在低浓度下，短时黑蒜的羟自由基清除能力显著高于鲜蒜与市售黑蒜（P＜0.05）。在中浓度下，鲜蒜的羟自由基清除能力显著高于短时黑蒜与市售黑蒜（P＜0.05）。在高浓度下，鲜蒜与市售黑蒜的清除率分别为59.19%和49.39%，短时黑蒜的羟自由基清除率达到87.05%，分别为鲜蒜和市售黑蒜的1.47和1.76倍，羟自由基清除能力显著高于鲜蒜与市售黑蒜（P＜0.05），且与低浓度下阳性对照VC的清除能力无显著差异（P＞0.05）。经计算可知鲜蒜、短时黑蒜与市售黑蒜的EC50分别为12.18，4.805和81.45 mg/mL。因此，短时黑蒜在高浓度下相较于鲜蒜与市售黑蒜有更好的清除羟自由基效果。

图3 鲜蒜、市售黑蒜与短时黑蒜羟自由基清除能力

2.1.4 Fe3+还原力测定

图4为鲜蒜、短时黑蒜、市售黑蒜以及阳性对照VC在低、中、高3个浓度下的Fe3+还原力。短时黑蒜的还原力在低、中、高浓度下均显著高于鲜蒜与市售黑蒜还原力（P＜0.05）。随着浓度升高，高浓度下短时黑蒜的还原力达到2.473，为市售黑蒜的1.7倍，鲜蒜的9倍，是相同浓度下阳性对照VC的还原力的85%。因此，短时黑蒜在还原力方面优于鲜蒜与市售黑蒜。

图4 鲜蒜、市售黑蒜与短时黑蒜Fe3+还原力

2.2 短时黑蒜中总酚提取的单因素试验结果与分析

2.2.1 溶剂浓度对短时黑蒜总酚得率的影响

如图5所示，溶剂浓度30%～50%时，短时黑蒜总酚得率随溶剂浓度升高呈上升趋势，溶剂浓度达到50%时，总酚得率到达最大值12.02 mg/g，随着溶剂浓度继续升高，总酚得率呈现下降趋势。可能的原因是短时黑蒜中多酚类成分的极性与50%乙醇溶液最为接近，此浓度下多酚更容易溶出。因此选择溶剂浓度50%作为最优水平。

图5 溶剂浓度对短时黑蒜总酚得率的影响

2.2.2 提取温度对短时黑蒜总酚得率的影响

如图6所示，提取温度30～40 ℃时，短时黑蒜的总酚得率出现短暂升高，在40 ℃达到最大值11.93 mg/g，提取温度40～70 ℃时，总酚得率随着温度升高而逐渐下降。可能的原因是在达到最佳提取温度之前随着温度的升高，多酚的析出与溶解得到促进，但随着温度继续升高，多酚的氧化速度被加快，空间结构遭到破坏，同时温度升高会促进杂质析出，与多酚结合形成沉淀，从而影响最终得率[16-17]。因此选择提取温度40 ℃作为最优水平。

图6 提取温度对短时黑蒜总酚得率的影响

2.2.3 提取时间对短时黑蒜总酚得率的影响

如图7所示，在10 min之前，随着时间的延长，总酚得率逐渐升高，在10 min时达到最大值12.09 mg/g，随着时间继续延长，总酚得率逐渐降低。由于在短时黑蒜生产过程中高温高压破坏大蒜的细胞结构，导致提取时间大幅减少。但随着提取时间继续延长，许多杂质成分溶解出来，与多酚结合沉淀，影响总酚得率[18]。因此选择提取时间10 min作为最优水平。

图7 提取时间对短时黑蒜总酚得率的影响

2.2.4 料液比对短时黑蒜总酚得率的影响

如图8所示，料液比从1∶5（g/mL）变化至1∶10（g/mL）过程中，短时黑蒜的总酚得率逐渐升高，料液比1∶10（g/mL）时达到最大得率12.07 mg/g，随着液体占比继续提高，总酚得率呈现缓慢下降趋势。这可能是由于液体占比较低时，提取溶剂达到饱和，随着液体占比逐渐升高，多酚得到更完全的溶解，但液体占比进一步提高，多糖、蛋白质等杂质成分析出增加，对多酚的稳定造成影响。因此选择料液比1∶10（g/mL）作为最优水平。

图8 料液比对短时黑蒜总酚得率的影响

2.3 短时黑蒜中总酚提取的响应面优化结果与分析

2.3.1 响应面设计与结果

以单因素试验结果为基础，使用Design-Expert 8.0.6设计响应面试验，结果如表2所示。

表2 响应面设计与结果

2.3.2 回归模型的建立及显著性分析

对响应面结果进行多元回归分析可得模型的回归方程：Y=11.88+0.12A+0.21B+0.19C-0.015D-0.035AB-0.51AC-0.63AD-0.50BC-0.60BD-0.56CD-0.43A2-0.64B2-0.53C2-0.52D2，R2=0.964 5。

表3为回归模型方差分析表。可以看出：模型的P值＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项为0.297 7＞0.05，不显著，相关系数R2=0.964 5，表明该模型可以较好反映在短时黑蒜多酚提取过程中的各因素之间的交互影响并对优化结果进行预测。

表3 回归模型方差分析表

通过比较F值可知，对于短时加工黑蒜总酚得率的影响大小可表示为B（提取温度）＞C（提取时间）＞A（溶液浓度）＞D（料液比），通过比较P值可知除了A（溶剂浓度）与B（提取温度）交互影响不显著外，其余交互作用均为极显著。

2.3.3 响应面分析

使用Design-Expert 8.0.6做出响应面图及等高线图，如图9所示，等高线图呈现出圆形或椭圆形，椭圆形的程度越大表明2个因素间的交互作用越明显，等高线越密集则该因素的影响越大，表现在响应面图上为模型越为陡峭。综合图形，对短时黑蒜总酚得率的影响排序为B（提取温度）＞C（提取时间）＞A（溶剂浓度）＞D（料液比）。

图9 四因素交互作用对短时黑蒜总酚得率影响的等高线图与响应面图

2.3.4 响应面结果验证

根据响应面模型拟合得到短时黑蒜中总酚提取的最优工艺：溶剂浓度45.48%、提取温度44.133 ℃、提取时间10.264 min、料液比1∶13.815（g/mL），预测的得率为11.97 mg/g。为方便实际操作，实际取值为溶剂浓度45%、提取温度44 ℃、提取时间10 min、料液比1∶14（g/mL）。在该条件下进行验证试验可得，短时黑蒜多酚得率为11.99 mg/g，与预测值极为接近，标准偏差为0.02，因此该模型作为优化短时黑蒜总酚提取得率的模型可靠。

2.3.5 纯化结果与体外抗氧化活性评价

经检测，大孔树脂D101纯化得到的短时黑蒜粗多酚中总酚含量为65.28%，与短时黑蒜粗提物和阳性对照VC对比DPPH清除能力结果如图10所示。短时黑蒜粗提物和粗多酚的EC50分别为0.94和0.12 mg/mL，相同质量浓度下粗多酚的DPPH清除能力均显著高于短时黑蒜粗提物（P＜0.05），且在0.6～1.0 mg/mL质量浓度下粗多酚的DPPH清除率高于阳性对照VC，可见短时黑蒜粗多酚具有极强的抗氧化能力。

图10 短时黑蒜粗提物与短时黑蒜粗多酚DPPH清除率

3 结果与讨论

通过对比与评价总酚含量、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力及Fe3+还原能力对鲜蒜、短时黑蒜及市售黑蒜的体外抗氧化活性，结果表明，短时黑蒜在总酚含量上显著高于鲜蒜，但与对比传统发酵型黑蒜无显著性差异，在DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和Fe3+还原能力方面均显著优于鲜蒜和市售黑蒜。其原因可能是短时黑蒜区别于传统黑蒜的前处理方式，高温高压前处理使得鲜蒜细胞结构破裂，酸性物质溢出使得pH降低，在酸和酶的作用下水解单宁水解产生小分子的分羧酸和多元醇，加速黑蒜多酚的产生，在此过程中产生的多酚在结构和种类与发酵黑蒜中可能存在差异，同时因加工工艺不同，产生如类黑素等活性物质也对短时黑蒜的抗氧化活性起到促进作用，需要进一步进行纯化和成分鉴定[19]。

作为黑蒜抗氧化活性的主体成分——多酚，近年来在功能性应用中备受关注，由于短时黑蒜的特殊加工在高温高压的预处理过程中使大蒜的细胞结构遭到一定程度的破坏，烘干打粉后短时黑蒜的内容物大量释放，更易融入乙醇溶剂液，与样品接触面积增大，因而提取效率较高，使得该方法消耗少、得率高[20-22]。 通过响应面法优化，得到短时黑蒜中总酚的提取工艺，即溶剂浓度45%、提取温度44 ℃、提取时间10 min、料液比1∶14（g/mL），最优提取工艺下短时黑蒜的总酚得率为11.99 mg/mL，与已有报道得率大致相同，但工艺上更为简便，耗时更短[23]。对优化后所得短时黑蒜粗提物使用大孔树脂D101进行初步纯化，得到总酚含量为65.28%的粗多酚产物，其DPPH清除率显著高于粗提物，随着质量浓度升高甚至高于阳性对照VC，表明短时黑蒜的抗氧化活性与其中多酚密切相关。

4 结论

短时黑蒜在总酚含量上显著高于鲜蒜，对比传统发酵型黑蒜无显著性差异，但其抗氧化能力优于鲜蒜和市售黑蒜。通过响应面法优化短时黑蒜中总酚的提取工艺，最优提取工艺下短时黑蒜的总酚得率为11.99 mg/mL。对优化后所得短时黑蒜粗提物使用大孔树脂D101进行初步纯化，得到总酚含量为65.28%的粗多酚产物，其DPPH清除率显著高于粗提物，表明短时黑蒜的抗氧化活性与其中多酚含量呈正相关。短时黑蒜相较于传统发酵型黑蒜具有更强的体外抗氧化活性，其多酚的进一步分离纯化对今后相关功能性产品的开发具有一定价值。