Dickkopf家族蛋白在动脉粥样硬化发生机制中的作用

邹璐蔚 李宗宇 刘春萍 杜晓玲 吕湛

(川北医学院第一附属医院，四川 南充637000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多种心血管疾病的主要病理基础，它由多种病理因素参与，包括内皮损伤及功能异常、慢性炎症、脂质浸润和泡沫细胞的形成等[1]。近年有研究发现了多种与AS发生机制相关的信号通路，其中Wnt信号通路得到了越来越多的关注，随着研究的深入，Dickkopf(DKK)家族蛋白作为Wnt信号通路的调节因子，与AS的关系也得到重视。现对DKK家族蛋白在AS发生发展机制中的作用做一综述，进而探讨DKK成为心血管疾病新型干预靶点和生物标志物的可能性。

1 DKK家族蛋白

DKK家族蛋白[2]是一类保守的分泌型糖蛋白。在脊椎动物中，DKK家族蛋白由255～350个氨基酸组成，共有DKK1～4四个成员，所有DKK家族蛋白均包含2个保守的富含半胱氨酸的结构域，其中DKK1、DKK2和DKK4结构高度相似，除此之外，DKK3还拥有一个位于N端的Soggy蛋白，这也导致了它与其他成员在功能上存在差异。研究发现，DKK家族蛋白可参与正常组织器官发育及多种疾病病理过程，例如发育缺陷、AS、癌症、神经退行性疾病和关节炎等。

2 Wnt/β-catenin信号通路简介

Wnt信号通路分为β-catenin依赖型信号通路(经典Wnt信号通路)和非β-catenin依赖型信号通路(非经典Wnt信号通路)，它参与许多复杂的生理病理活动和生化反应，失调的Wnt信号通路不仅可能促进癌症细胞的增殖和迁移，还可能参与心血管疾病的发病[3]。经典Wnt信号通路是通过Wnt信号配体与7次跨膜受体卷曲蛋白(Frizzled受体，Fz受体)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)三者结合，信号传递后可减弱由β-catenin与轴蛋白、糖原合成酶激酶-3β、结直肠腺瘤性息肉基因组成的降解复合物(后称泛素-蛋白酶体系统)的稳定性，阻止β-catenin被磷酸化降解，促进β-catenin在胞质内积聚，从而使大量游离的β-catenin进入细胞核，参与调控下游基因表达。

目前许多国内外学者的研究[4]表明，经典Wnt信号通路可能作为重要一环参与AS的发生。Du等[5]通过测定大鼠AS模型中炎症细胞因子含量以及Wnt信号通路相关蛋白的表达水平，与对照组对比得出，AS导致的炎症环境可激活动脉壁中的Wnt信号通路，并导致血管内皮功能障碍，破坏血管内皮的屏障功能。

3 DKK1

DKK1作为DKK家族蛋白代表型成员，在肿瘤学领域中被认为是很有希望的一类抗癌治疗靶点，随着对其深入的研究，发现DKK1也参与到脂质浸润、内皮细胞损伤及功能减退、炎症反应、血管钙化等AS病理过程中，进而开始探讨它作为AS治疗新靶点和心血管疾病预后预测指标的可能性。

3.1 DKK1与Wnt信号通路

DKK1主要通过两种方式负调节Wnt信号通路[6]：(1)竞争性抑制LRP5/6，从而减少经典Wnt信号通路中的配体-Fz-LRP5/6三元复合物形成；(2)DKK1与LRP5/6、跨膜蛋白Krm(Kremen)形成三元复合物，同时触发内吞并降解LRP5/6，导致细胞膜上的LRP5/6含量降低。通过以上两种途径，DKK1可抑制Wnt信号，一旦Wnt信号无法下传，泛素-蛋白酶体系统活化并降解β-catenin，从而使其不能入核参与调控基因表达[7]。细胞膜上LRP5/6水平的降低可导致脂质及糖类代谢紊乱，引起人体内低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和血糖水平升高[8]。此外，DKK1还有可能通过直接或间接的方式改变经典与非经典Wnt信号通路的平衡，进而影响非经典Wnt信号通路，但其具体方式尚未明确[9]。

3.2 DKK1与AS

Ueland等[10]分别测定了心绞痛组和健康对照组中的血清DKK1水平，发现心绞痛组(特别是不稳定型心绞痛患者组)显著高于健康对照组；他们还分别测定了心绞痛组与健康对照组在血小板缺乏的血浆中的DKK1水平，发现两组水平无显著差异，从而推论心绞痛患者的血小板在聚集激活过程中可迅速释放大量DKK1。同时，Ueland等[10]在对患者斑块破裂部位的血小板以及有症状的颈动脉斑块的内皮细胞进行免疫染色后，观察到DKK1染色阳性，提示DKK1可能参与AS的发生发展，由此国内外学者开始对DKK1在心血管疾病特别是AS中的作用机制进行研究。

3.2.1 DKK1参与脂质浸润

巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白，形成泡沫细胞，刺激平滑肌细胞迁移并产生细胞外基质成分，进而形成纤维帽。在Borrell-Pagès等[11]的实验中，将小鼠分为lrp5-/-小鼠组与正常小鼠组，并将每一组内的小鼠分为普通饮食组和高脂饮食组，喂养8周后，对小鼠血清胆固醇及AS病变程度进行量化，观察到高脂饮食的lrp5-/-小鼠血液中胆固醇水平的总体增长比高脂饮食的正常小鼠更明显。同时，还观察到无论是lrp5-/-小鼠组，还是正常小鼠组，经高脂喂养后，小鼠的胸主动脉区域脂质沉积都有增加，其中lrp5-/-小鼠组较正常小鼠组更明显。这提示了DKK1诱导脂质浸润的一种潜在机制，即DKK1可通过触发内吞和降解LRP5/6，导致细胞膜上的LRP5/6含量降低，从而参与脂质和巨噬细胞在血管壁中的滞留。

3.2.2 DKK1诱导内皮细胞凋亡

内皮细胞受损导致细胞膜通透性增高，促炎因子积聚，炎性反应增强，巨噬细胞死亡，进而导致易损斑块形成和破裂。Di等[12]在AS小鼠模型中分别过度表达DKK1和沉默表达DKK1，并在一段时间的高脂饮食喂养后，观测到过度表达组小鼠动脉粥样斑块的面积比沉默表达组明显增大，且内皮细胞凋亡增加，加剧了斑块不稳定性。进一步研究发现，DKK1是通过抑制经典Wnt信号通路，并激活JNK信号转导通路，随后激活IRE1α和eIF2α/CHOP通路，最后通过诱导内皮细胞凋亡，促进斑块形成并增加其脆性。

3.2.3 DKK1参与炎症反应

炎症机制参与了AS发生发展全过程，增加斑块的不稳定性，贯穿内皮损伤、斑块形成与破裂等阶段。Ueland等[10]研究DKK1是否参与炎症反应，通过沉默DKK1的表达后测量评估人体炎性因子水平，发现经过处理后的人脐静脉内皮细胞中单核细胞趋化蛋白-1、白介素(IL)-8和IL-6水平显著降低，提示DKK1参与血小板与内皮细胞的炎症作用。同时，在Lattanzio等[13]的一项横断面研究中，将214例2型糖尿病患者与30例健康人进行对比，结果显示糖尿病组的血浆DKK1水平显著高于健康对照组。之后还将这214例糖尿病患者分为接受低剂量阿司匹林治疗组(阿司匹林100 mg/d)与未接受低剂量阿司匹林治疗组，发现前者血浆DKK1水平较后者明显降低，提示DKK1参与机体炎症反应。还有研究[14]，在一些急性感染性疾病(如肺炎、病毒感染等)和慢性炎症(如结肠炎等)中，也都观察到不同程度的DKK1水平升高。综上，DKK1参与了机体炎症反应微环境的形成。

3.2.4 DKK1与血管钙化

血管钙化是心血管疾病的常见病理类型，涉及动脉中矿物质沉积等复杂过程并受多种途径的调节，其中就包括Wnt信号通路。之后的一系列研究表明，DKK1作为Wnt信号通路拮抗剂可能参与血管钙化的形成，还可能影响血管斑块的稳定性。Szulc等[15]在60岁以上的男性人群中观察到，DKK1水平越低的患者发生腹主动脉钙化的严重程度越高，在之前对患有2型糖尿病的非裔美国人[16]和绝经后妇女[17]的研究中也观察到了血浆DKK1水平与血管钙化的严重程度呈负相关的结果。结合DKK1在不稳定的AS斑块中含量很高这一现象，提示DKK1可能影响斑块的组成成分，比如通过抑制保护性片状钙化的形成来增加斑块的不稳定性[18]。相反的是，Motovska等[19]的研究发现在冠状动脉造影正常的主动脉瓣钙化患者中，血浆DKK1水平与主动脉瓣钙沉积程度呈正相关。这提示DKK1可能通过不同机制影响血管及瓣膜的钙化，有待进一步的研究来证实。

3.3 DKK1作为药物作用靶标

基于上述观点，许多学者针对DKK1能否作为新型药物作用靶标进行了一系列动物研究及体外研究。Pontremoli等[20]对高脂饮食兔组应用阿托伐他汀治疗[2.5 mg/(kg·d)]连续8周，与普食兔组相比，前者的血浆DKK1水平低于后者。进一步采用基于蛋白质组学和DKK1基因沉默的联合策略，对照得出阿托伐他汀作为甲羟戊酸途径抑制剂可通过抑制Cde42、Rho和Rac蛋白来影响基因表达并下调DKK1蛋白。但Rakipovski等[21]使用DKK1抗体降低AS小鼠模型的DKK1血浆浓度后，发现并未改变病变处的粥样斑块面积，这可能是因为斑块中缺乏DKK1的表达。目前对于DKK1能否作为AS治疗的新型靶标尚无定论，且在肿瘤学领域中，DKK1被证明在大多数肿瘤中可促进肿瘤生长和转移，这提示针对DKK1的治疗方案具有两面性，所以还需更深入的研究来探讨DKK1作为药物作用靶标的可能性。

3.4 DKK1预测心血管疾病的预后

近期一些观察性研究表明了患者血浆DKK1水平可能与心血管疾病预后有关。Wang等[22]为评估DKK1与急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)的关联，在对291例ACS患者为期2年的随访中，有44例(15.1%)发生了主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)，追溯其入院24 h DKK1水平，发现患者MACE发生率随DKK1水平的升高而增加。对比GRACE评分中的各项指标，其认为入院24 h DKK1水平是ACS患者预后发生MACE的高风险长期预测因子，并主张将其纳入GRACE风险评分，从而增强对ACS患者预后的评估能力。而Ueland等[23]持不同意见，他们认为前者的试验未考虑到其他重要生物标志物(例如N末端脑钠肽前体、高敏肌钙蛋白T和生长分化因子15等)的情况，于是收集了5 165例ACS患者在入院、出院、随访1个月和6个月这四个时间点的DKK1水平，在对临床变量及其他重要生物标志物进行多变量调整后，观察到DKK1水平与心血管死亡风险之间存在独立的关联，但随访1个月这一时间点的DKK1水平变化与未来的不良结局无关。同样，Klingenschmid等[24]的研究结果也证明人血浆DKK1水平与脑卒中、心肌梗死和冠心病等心血管疾病的发生独立相关，他们在基于人群的前瞻性Bruneck研究中，对706例参试者进行了为期16年的随访，结果证明DKK1水平越高，罹患心血管疾病的风险越高，因此也主张DKK1有作为预测心血管疾病风险的生物标志物的潜力。

4 DKK3

DKK3基因位于染色体11p15.3，在人体心、脑等器官中广泛表达，与DKK1、DKK2和DKK4不同，它携带一个特殊的Soggy蛋白，这使得它与其他DKK家族成员在功能上存在差异。之前的研究主要认为DKK3是一种潜在的肿瘤抑制因子，在胰腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中展现出了抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。现有研究显示DKK3还可抑制AS的发生发展，对心血管有保护性作用。

在一项观察性研究中，Wang等[25]发现人体血清DKK3水平与40～60岁无临床症状中年人患严重冠状动脉狭窄的风险呈反比，提示DKK3可能在AS发展过程中起负调节的作用。这可能与DKK3可通过转化生长因子-β/激活转录因子6和Wnt信号通路，诱导干细胞和成纤维细胞分化为平滑肌细胞有关，在Karamariti等[26]的实验中，首先通过比较DKK3-/-/载脂蛋白E-/-小鼠与DKK3+/+/载脂蛋白E-/-小鼠的斑块质量，发现前者存在易损斑块，后者斑块内巨噬细胞浸润减少、基质蛋白沉积增加、出血减少，这表明DKK3可能影响斑块的组成和形成。此外通过体外分化研究，他们发现DKK3可刺激血管前体干细胞和成纤维细胞分化为平滑肌细胞，加强斑块的稳定性。同样，Chen等[27]的研究证明，DKK3能通过血管内皮生长因子/microRNA-125a-5p/STAT3信号通路诱导成纤维细胞分化为功能性内皮细胞，这可能使斑块破裂出血减少，提高斑块稳定性。此外，Zhu等[28]在对3 344例缺血性卒中患者的为期3个月的随访中发现，血清DKK3水平与缺血性卒中后3个月内死亡和血管事件的发生风险呈反比，这提示DKK3可能是缺血性卒中的预后生物标志物。

目前的证据表明，DKK3可在动脉粥样斑块形成的早期阶段发挥关键作用，影响斑块的组成，促进血管修复，并减缓AS的进展过程，但其潜在过程及影响尚不明确，仍需进一步的研究来阐明DKK3在AS发生发展过程中的作用及相关机制。

5 其他DKK家族蛋白

目前在心血管疾病领域，对于DKK家族蛋白的研究主要集中在DKK1与DKK3，而对DKK2及DKK4研究相对较少。研究[29]发现，DKK4可能与卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤有关，参与结直肠癌的化疗抵抗。与其他DKK家族成员相比，它在AS中的作用尚不明确。

巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白，进而形成泡沫细胞。DKK2在激活巨噬细胞这一过程中起着重要作用，Zhang等[30]在AS模型小鼠的骨髓衍生巨噬细胞中，发现了DDK2主要位于巨噬细胞质中，他们进一步沉默DKK2的表达后，发现泡沫细胞的形成明显减少，这可能与DKK2水平下降后，Wnt信号通路受到的抑制减少有关。

目前已知当血管内皮细胞处于紊乱的血流环境中时，内皮细胞会发生表型变化，出现通透性及细胞因子释放增加，导致白细胞黏附，从而促进AS。由此，Li等[31]通过单细胞RNA测序技术，测定在紊乱的血流状态下颈动脉内的细胞种类及亚群，发现在其中一个亚群中表达最高的基因是DKK2，这提示DKK2可能通过调节内皮功能参与AS的发生发展。

综合上述国内外研究，DKK家族蛋白可能参与AS和心肌梗死等多种心血管疾病的发生机制，还可能作为AS潜在的干预靶点，或作为生物标志物用于对患者心血管疾病风险进行分层，但由于不同的研究者发布的研究结果存在不一致性，甚至存在研究结论截然相反的情况，因此，对于DKK家族蛋白参与AS发生发展过程的确切机制，尚需进一步深入探究。