代谢相关脂肪性肝病血清生物标志物研究进展

刘雪冰 丁洁霞 金洁 范震 朱婧

随着现代人生活方式、饮食习惯的改变，代谢相关脂肪性肝疾病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）的发病率日益升高［1］，按照疾病进程可将MAFLD分为代谢相关性脂肪肝（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）和代谢相关性脂肪性肝炎（metabolic associated fatty liver disease，MASH），前者通常是良性病变，但后者可能进展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），严重危害身体健康。目前全球有约25%的人患有MAFLD，在我国MAFLD患病率已达29.2%［2］，MAFLD逐步成为我国慢性肝病的主要原因。由于MAFLD起病隐匿，缺乏典型特征，且临床表现、疾病进展、预后差异很大，易造成临床干预不及时，导致不良预后［3］。因此，准确诊断MAFLD患者的脂肪变、炎症和纤维化程度，识别进展性肝纤维化和MASH对于确定治疗时机、方法以及判断预后具有重要意义。研究发现较多血清标志物与MAFLD疾病进程密切相关，成为诊断MAFLD并预测其进展的重要方法之一［4］。本文旨在阐述可能用于诊断和评估MAFLD的血清标志物，为MAFLD的无创检验提供指导。

1 细胞角蛋白-18（cytokeratin 18，CK-18）

CK-18被认为是目前MASH诊断和分级的最有价值的血清标志物之一。其是一种中间丝蛋白，在肝脏蛋白中占5%［5］，作为肝细胞膜中的一种重要骨架蛋白，CK-18能够保护肝细胞抵抗压力，起到维持肝细胞形态的作用。在肝脏凋亡过程中，CK-18由天冬氨酸蛋白水解酶在Asp 396位点裂解为M30和M65两个片段［6］。因此当MASH肝细胞发生凋亡时，血清中CK-18及其裂解产物M30和M65的水平也随之升高。KAWANAKA等［5］研究发现，当CK-18＞ 375 U/L时，其诊断MASH的AUC为0.79，敏感性81.5%，特异性65%；FELDSTEIN等［7］研究表明，在诊断MASH时，基于CK-18（AUC 0.83）的预测明显优于AST（AUC 0.64）、ALT（AUC 0.58）和γ-GT（AUC 0.57），可作为MASH的独立预测因子，该报道指出，CK-18血浆水平每增加50 U/L，发生MASH的可能性就增加30%；此外，MASH患者中出现肝脏纤维化进展的血清CK-18片段水平明显高于未发生纤维化的患者；HE等［8］在2017年发表一项Meta分析，认为当CK-18的m30片段截断值为121.6～380.2 U/L时，其相应的敏感度为0.60～0.95，特异度为0.60～0.97，AUC为0.66～0.93；CK-18的m65片段截断值为243.8～790 U/L时，其相应的敏感度为0.62～1，特异度为0.65～0.89，AUROC为0.71～0.93。上述研究表明，CK-18可作为检测MASH的一种独立血清标志物，并具有较高的敏感度及特异度。但HE等［8］也提出，多种血清标志物联合使用构成的评价体系（如MACK-3，包括 AST、HOMA和CK18）比单独使用CK-18更能提高其诊断MASH的准确性。

2 成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor-21，FGF-21）

FGF-21存在于多种器官和组织中，如肝脏、胰腺、脂肪、肌肉等。FGF-21是一种内分泌信使，通过激活胆汁酸-法尼类X受体（FXR）轴来控制限速酶CYP7A1的表达，后者是肝脏中胆汁酸经典合成途径的限速酶，因此FGF21被认为是调节胆汁酸/胆固醇合成的关键因素，能够起到减少肝脏脂肪积累、降低炎症及纤维化水平、从而逆转肝脏脂肪变性的功能［9］。HE等［8］认为，其诊断评分、诊断比值比、敏感度和特异性分别为1.74（95%CI 1.22～2.26）、5.70（95%CI 3.38～9.62）、0.62（95%CI 0.50～0.73）和0.78（95%CI 0.70～0.84）；BARB等在一项包含187个病例的横断面研究中发现：血浆FGF-21浓度的升高与胰岛素抵抗及MASH的严重程度密切相关，且随肝脏炎症坏死的严重程度而增加（P=0.02），在纤维化的过程中最为显著，但不随脂肪变性而变化［10］。

3 血清铁蛋白（serum ferritin，SF）

人体内的铁主要由二价铁及三价铁组成，铁蛋白可结合三价铁并大量存在于肝脏中，使肝脏成为体内最大的储铁器官。对肝细胞和肝组织的许多体外和体内研究表明，肝铁负荷的增加可引起氧化应激反应，导致铁代谢失衡及肝细胞损伤，铁蛋白释放入血使得血清铁蛋白含量增高。因此，SF一定程度上能够反映肝细胞坏死的严重程度［11］。KOWDLEY等［12］在一项628例经活检证实的MAFLD且伴高铁蛋白血症的队列中发现，血清铁蛋白＞1.5倍正常上限值（ULN）的患者具有更为显著的MAFLD组织学特征，并与肝脏晚期肝纤维化及MAFLD活动分数成正相关，从而指出血清铁蛋白升高是MAFLD患者组织学严重程度和晚期纤维化的独立预测因子，可用于识别患有MASH和具有晚期纤维化风险的MAFLD患者；BUZZETTI等［13］在一篇纳入468名经活检证实为MAFLD的队列研究发现，铁蛋白水平随着肝纤维化的恶化而增加，但不是晚期纤维化的独立预测因子。GOH等［14］在一项纳入405名活检证实MAFLD的患者的研究中发现，血清铁蛋白水平升高与MASH的存在呈正相关，但他同时也指出，单独使用铁蛋白诊断MASH的准确性有限，将其纳入脂肪性肝炎预测评分（NPS）可以有效提高MASH诊断的准确性。

4 血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）

HO-1又被称作热休克蛋白32（HSP32），是一种重要的氧化应激蛋白，可由多种氧化剂诱导，在心脏、肺脏、肝脏、脾脏等器官都有分布，是将血红素分解为胆绿素、一氧化碳（CO）和游离二价铁这一过程的起始酶和限速酶。多项研究表明，HO-1可以通过分解血红素产生的CO及游离二价铁降低细胞生长抑制，减少细胞凋亡。此外，HO-1也可以降低炎症因子表达（如TNF-α），从而起到抗氧化应激、抗炎从而保护肝细胞的作用［15］。MALAGUARNERA等在一项纳入了60名病例的研究中发现，MASH患者的HO-1表达与MASH的程度呈正相关，反映了疾病的严重程度。同时也指出，HO-1与铁蛋白水平、脂质过氧化物之间也有着显著相关性［16］；苑喜微等在一项共纳入441例病例的回顾性研究中发现，血浆HO-1水平随MAFLD发病及进展依次递增，可作为影响MAFLD进展的独立因素（OR值1.363，P＜0.05），基于ROC曲线（AUC 0.962）分析其灵敏度为85.10%，特异度为92.9%，并指出，MASH中HO-1升高可能是机体的一种自我保护机制［17］。综上所述，HO-1可以减少肝脂肪变性，降低炎症因子表达，保护肝细胞的作用，作为负调控因子间接反映MASH的严重程度。当前有多种基于强化HO-1表达用以治疗MASH的药物正在研究中。

5 血小板反应蛋白2（thrombospondin-2，THBS2/TSP2）

血小板反应蛋白家族是一种细胞外基质（ECM）中具有多结构域的分泌型Ca2+相关糖蛋白，包括THBS1、THBS2、THBS3、THBS4和THBS5，它们能够直接或间接与多种细胞因子、生长因子、细胞受体、蛋白酶和细胞外基质等相互作用，从而调节不同类型细胞对环境刺激的活性，诱导细胞黏附、运动和分化［18］。其中，由THBS2基因编码的THBS2/TSP2主要在成纤维细胞中表达，能够促进胶原蛋白及纤维蛋白的形成、骨骼生长、维持血管密度、止血和细胞黏附特性等，在伤口修复和组织重塑过程中起作用［19］。CALABRO等［20］研究表明，在THBS基因敲除的小鼠皮肤组织中，纤维胶原蛋白、结构蛋白、ECM相关蛋白水平均出现了一定程度的降低。TAKEFUMI KIMURA等在一项纳入130个病例的回顾性横断面研究中发现，血清TSP2水平与MAFLD病理特征分级具有显著相关性，如脂肪变性（r=0.23，P=0.008）、小叶炎症（r=0.37，P＜0.001）、气球变性（r=0.56，P＜0.001）和纤维化（r=0.53，P＜0.001）呈正相关，在气球变性和纤维化过程中最为显著；KIMURA等发现，在气球变性中，TSP2的AUC为0.78，界值（cutoff）为14.4 ng/mL，相应的敏感度为72%，特异度为75%，阳性预测值为41%，阴性预测值为92%；在肝纤维化中，TSP2的诊断相关指标随分期改变而不同，当TSP2界值在17.9～28.2 ng/mL之间时，相应AUC为0.73～0.82，敏感性为85～93%，特异性为35%～65%，阳性预测值为36～89%，阴性预测值为69%～97%。对比MAFLD的5个常规参数-CK-18 M30、血清透明质酸（HA）、IV型胶原蛋白7S（IV-C7S）、APRI评分和FIB-4评分，THBS2在预测气球变性方面表现出的相关性最高（r=0.56），其次为脂肪变性和小叶炎症［19］。综上，鉴于THBS2在肝细胞气球变性和纤维化中的显著相关性，可将其认为是具有良好前景的诊断MASH非侵入性指标之一。

6 IV型胶原蛋白（IV collagen protein，IV-C）

IV-C是形成基底膜的细胞外基质（ECM）的一部分，由三个片段组成：N端7S片段、中心三螺旋片段和C端NC1片段。有研究表明，在肝纤维化过程中，肝星状细胞被激活后转化为肌成纤维细胞，分泌促纤维化因子和过量的细胞外基质（ECM）蛋白，IV型胶原蛋白及其片段作为ECM组成部分与纤维化的进展密切相关，其血清水平能够有效反映肝纤维化的严重程度［21］。MASAYUKI等在一项纳入184例患者的回顾性研究中发现，经活检诊断为MASH的患者血清IV-C7S高于MAFL患者［21］。STEFANO等［22］在一项纳入126例经活检证实为MAFLD患者的回顾性研究中发现，IV-C在诊断显著纤维化（F2-F4）和晚期纤维化（F3-F4）的准确度均高于透明质酸（HA）、原胶原蛋白III型（PCIII）、层粘连蛋白（LN）和胆碱甘氨酸（CG），IV-C高于30ng/mL的患者相比低于此值的患者进展为显著纤维化（F2-F4）的风险高5.57倍，发生晚期纤维化（F3-F4）的风险高7.61倍。此外，也有不少研究人员以IV-C7S片段为检测指标评估MASH程度。TAKESHI在一项纳入156例患者的回顾性研究中发现，IV-C7S可作为MASH（AUC0.825，敏感度26.8%，特异度31.4%）和MASH相关纤维化（AUC0.895，敏感度95.2%，特异度96.3%）的有效预测因子，并指出相比炎症和脂肪变性，IV-C 4S对肝纤维化的预测准确性更高［23］。因此，IV-C及IV-C7S片段对纤维化程度的预测准确性尤其灵敏，可有效反映MASH的疾病进展。

7 脂联素（Adiponectin）

脂联素是一种脂肪细胞因子（包括脂联素、TNF-α，瘦素和抵抗素），能够通过结合其受体AdipoR1和AdipoR2激活AMPK途径和PPARα途径，抵抗炎症反应、促进葡萄糖摄取并增强脂肪氧化，减少脂质合成，从而降低脂肪浸润，改善胰岛素抵抗，促进MASH恢复，改善肝纤维化［24］。在MAFLD患者中，脂联素的浓度降低，引起脂肪因子失衡导致疾病的进展。KAMADA等［25］在脂联素基因敲除（KO）的MASH小鼠模型中发现，KO小鼠的肝脏脂肪变性程度比野生组（WT）小鼠更明显，14只KO小鼠中有6只进展为肝硬化和肝肿瘤，而15只WT小鼠仅表现为单纯性脂肪变性，表明低脂联素血症可能是MASH相关肝肿瘤形成的危险因素。陈丽丽等［26］在一项纳入82例患者的回顾性研究中发现，重度MASH患者的血清APN水平均显著低于轻度组和中度组（P＜0.05）。多项研究发现，APN的水平与MAFLD病情严重程度呈负相关，表明脂联素及其激动剂有可能成为治疗MAFLD的新药物，但脂肪因子作用机理复杂仍需进一步研究，目前尚不能作为诊断MAFLD的独立预测因子。

8 角鲨烯环氧化酶（squalene epoxidase，SQLE）

胆固醇是MASH发生过程中的主要脂毒性分子，SQLE是其生物合成的限速酶，能通过与碳酸酐酶III（CA3）结合驱动脂肪生成，增加肝细胞中胆固醇和胆固醇酯的积累，在MASH及相关的肝癌（MAFLD-HCC）的发展中发挥作用。LIU等［27］在一项针SQLE在MASH中功能作用、分子机制和临床影响的研究发现，SQLE及CA3在脂肪变性及MASH中都出现过度表达，与单独测定血清SQLE（AUROC 0.816；95%CI，0.758～0.873）及CA3（AUROC 0.899，0852～0.946）相比，两者相结合用于诊断MAFLD和MASH的AUROC更高，为0.927（95%CI，0.890～0.964）。SQLE可通过与CA3的相互作用引发自发性脂肪生成，激活炎症信号，导致MASH。在小鼠模型中，SQLE抑制剂（如特比萘芬）及CA抑制剂（如乙酰唑胺）联合靶向治疗可以逆转肝损伤和氧化应激过程。因此，SQLE通过诱导胆固醇生物合成和SQLE/CA3 轴介导的脂肪生成来驱动MASH的发生和进展。血清SQLE和CA3是MASH患者无创诊断的新型生物标志物。针对SQLE和CA3的联合靶向治疗对MASH有益。

近年来，研究发现多种血清生物标志物用于MAFLD的诊断和病情评估，具有无创、操作简易、重复性高、可量化等优点，且在MAFLD的随访中具有较大的发展前景。众多学者认为，在检测血清生物标志物的基础上，将多种临床指标结合用于评估MAFLD疾病进程逐渐成为一种行之有效且准确率高的方法，能够在临床应用中提高诊断MAFLD的准确率，做到早期诊断，早期治疗，减少不良预后的发生。