血根碱通过TGF-β1/Smad通路抑制化疗耐药性宫颈癌细胞的增殖

汤丽丽，郭洁，李晶，刘蓉，范晓静

（1.邯郸市第一医院妇产科，河北邯郸 056002；2.邯郸市第一医院纺医院区麻醉科，河北邯郸 056002；3.邯郸市第一医院财务科，河北邯郸 056002）

宫颈癌（cervical cancer）是女性常见的恶性肿瘤。铂类抗肿瘤药物是宫颈癌重要的化疗药物，包括顺铂（cisplatin，DDP）、卡铂等[1-2]。临床中，DDP比卡铂更常用，但患者DDP耐药性的产生限制了DDP的广泛应用[3-4]。因此，提高宫颈癌细胞的DDP敏感性和逆转DDP耐药性具有重要的研究意义。来源于植物的天然产物在抗肿瘤药物领域占有重要的地位[5-6]。血根碱（sanguinarine）是从白屈菜、博落回罂粟科植物中提取的一种苯菲啶异喹啉类生物碱，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗真菌，改善肝功能，提高免疫力等多种药理活性[7-10]。近年研究发现，血根碱具有抗肿瘤作用，可有效抑制结直肠癌、胰腺癌和乳腺癌等[11-13]；但尚未见其在宫颈癌中应用的研究。因此，本研究以DDP耐药的人宫颈癌Hela细胞（HeLa/DDP）为模型，探讨血根碱对HeLa/DDP细胞增殖的影响，以期阐明血根碱抗宫颈癌DDP耐药的作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养 人宫颈癌HeLa细胞，购自上海奥陆生物科技有限公司。HeLa细胞以含有10%胎牛血清、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基在5%CO237℃条件下培养。

1.2 药物、试剂与仪器 血根碱（≥98%，成都曼思特生物科技有限公司生产，分子式：C20H14NO4；分子量：332.33）；DDP，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产，批号：C295225。转化生长因子β1（TGF-β1）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；10%胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）检测试剂盒、蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；牛血清白蛋白（BSA）（美国Millipore公司）；TGF-β1、p15、Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、β-肌动蛋白（β-actin）等鼠抗兔多单克隆抗体（英国Abcam公司）；含有辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔IgG抗体（美国CST公司）；ECL发光液（美国Thermo Fisher Scientific公司）。Synergy H4全功能酶标仪（美国BioTek公司）；PowerPac Basic电泳仪、Gel Doc XR一体式凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 顺铂耐药细胞株HeLa/DDP模型构建 取处于对数生长期的HeLa细胞，以100倍半数抑制浓度（IC50）为诱导剂量，用DDP诱导培养2 h后撤去含药培养基，用PBS漂洗3次，加入常规培养基继续培养，每天换液去除死细胞。10～15 d后，存活的细胞生长恢复，进入对数生长期后进行消化处理。传代3次后，重复上述操作4次。之后延长药物作用时间为4 h，重复8次。总计加药作用12次，诱导过程共历时6个月，最后得到DDP耐药细胞株HeLa/DDP。

1.4 实验分组 分3组：Hela/DDP组、Hela/DDP+DMSO组、Hela/DDP+血根碱组。Hela/DDP组为空白对照组，只给予原培养基处理；Hela/DDP+血根碱组为血根碱处理组，给予2μmol/L血根碱[14]（0.1%DMSO为溶媒）处理；Hela/DDP+DMSO组为阴性对照组，给予与血根碱相同体积的溶媒0.1%DMSO处理。

在随后的拯救实验中，分4组：DMSO组、血根碱组、生理盐水+血根碱组、TGF-β1+血根碱组。DMSO组、血根碱组的处理方式与上述分组相同；TGF-β1+血根碱组给予5 ng/mL TGF-β1[15]（以生理盐水为溶媒）预处理6 h，然后加入2μmol/L血根碱后培养72 h；生理盐水+血根碱组给予相同体积的生理盐水合相同浓度的血根碱进行处理。

1.5 MTT法测定HeLa/DPP细胞增殖能力 将HeLa/DDP细胞接种于96孔板中，2×104/孔，在DMEM培养基中培养6 h。随后按照“1.4”项分组处理24、48、72 h。将MTT（5 mg/mL）加入培养基中，并用150μL DMSO溶解甲臜晶体。应用酶标仪以490 nm波长读取吸光度（OD）数值。计算细胞生长抑制率，公式：细胞生长抑制率（%）=（对照组OD平均值-实验组OD平均值）/对照组OD平均值×100%。并计算半数最大抑制浓度（IC50）。

1.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测HeLa/DDP细胞TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p15蛋白表达 将HeLa/DDP细胞接种到48孔板中，2×105/孔，细胞贴壁6 h后再按照“1.4”项分组处理72 h。用蛋白提取试剂盒提取细胞内蛋白并通过BCA法测定蛋白质浓度。每个泳道上样15μg蛋白质进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），然后将分离胶上的蛋白样本电转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室温下用TBST溶解的5%BSA封闭40 min。然后将膜与指定的一抗[TGF-β1（稀释比1∶1 000）、p-Smad2（稀释比1∶2 000）、Smad2（稀释比1∶2 000）、p15（稀释比1∶1 000）和β-actin（稀释比1∶2 000）]在4℃孵育过夜，在室温下用HRP标记的山羊抗兔二抗（稀释比1∶5 000）孵育40 min。每个步骤完成后采用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次5 min。应用ECL发光液显影。最后，采用ImageJ软件分析电泳条带，结果以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值表示。

1.7 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，然后进行最小显著性差异检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌Hela/DDP细胞株模型的建立 以亲本宫颈癌细胞系HeLa为基础，建立DDP耐药细胞株HeLa/DDP模型。采用MTT法观察HeLa细胞系DDP耐药水平。对DDP敏感的HeLa和DDP耐药的HeLa/DDP细胞用不同浓度（0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL）的DDP处理48 h，确立半数最大抑制浓度（IC50）值分别为5.821μg/mL和28.88μg/mL，结果见图1。HeLa/DDP细胞系的IC50值约是HeLa细胞系的5倍，表明HeLa/DDP对DDP的耐药性明显高于HeLa细胞。

2.2 血根碱抑制HeLa/DDP细胞的增殖 为了观察血根碱对Hela/DDP细胞增殖的影响，给予血根碱处理HeLa/DDP细胞24、48、72 h。图2结果显示，与未经血根碱处理的细胞相比，血根碱处理的HeLa/DDP细胞的生长抑制率显著增加（P＜0.05），表明血根碱可以抑制HeLa/DDP细胞的增殖。

图2 MTT法测定HeLa/DDP细胞生长抑制率结果Figure 2 Results of the growth inhibition rate of HeLa/DDP cells by MTT assay

2.3 血根碱通过TGF-β1/Smad信号通路调控Hela/DDP细胞增殖 采用Western Blot法检测血根碱诱导Hela/DDP细胞TGF-β1/Smad通路中TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表达水平，结果如图3所示：与Hela/DDP+DMSO组比较，Hela/DDP+血根碱组中的TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表达水平降低（P＜0.05）；同Hela/DDP组相比较，Hela/DDP+DMSO组0.1%DMSO对上述3种分子的蛋白表达无明显影响。

图3 血根碱对Hela/DDP细胞转化生长因子（TGF）-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表达的影响Figure 3 Effect of sanguinarine on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in Hela/DDP cells

2.4 TGF-β1缓解了血根碱诱导的Hela/DDP细胞增殖抑制 本研究进行了拯救实验，以5 ng/mL TGF-β1对Hela/DDP细胞进行了预处理。图4结果显示：与生理盐水+血根碱组比较，TGF-β1+血根碱组Hela/DDP细胞生长抑制率显著下降（P＜0.05）；血根碱组与生理盐水+血根碱组间Hela/DDP细胞生长抑制率比较无显著性差异（P＞0.05）。

图4 转化生长因子（TGF）-β1对血根碱诱导Hela/DDP细胞增殖的影响Figure 4 Effect of TGF-β1 on the proliferation of sanguinarine-induced Hela/DDP cells

2.5 TGF-β1缓解了血根碱诱导Hela/DDP细胞的TGF-β/Smad信号失活 此外，TGF-β1还逆转了血根碱所诱导的Hela/DDP细胞Smad2磷酸化和p15的表达抑制。图5结果显示，TGF-β1+血根碱组Hela/DDP细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15的蛋白表达水平明显高于生理盐水+血根碱组（P＜0.05），表明TGF-β1可以缓解血根碱诱导Hela/DDP细胞的TGF-β1/Smad信号失活。

图5 转化生长因子（TGF）-β1对血根碱诱导Hela/DDP细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2和p15蛋白表达的影响Figure 5 Effects of TGF-β1 on protein expressions of TGF-β1，p-Smad2/Smad2 and p15 in sanguinarineinduced Hela/DDP cells

3 讨论

顺铂（DDP）对晚期或复发性宫颈癌治疗最为有效[16]。越来越多的证据表明，靶向线粒体、诱导DNA损伤进而导致细胞凋亡是DDP化疗治疗宫颈癌的主要作用[17-18]。然而，基于DDP化疗的内在或获得性耐药已成为许多癌症治疗中的挑战。血根碱具有良好的抗肿瘤活性，本研究发现，2μmol/L血根碱显著降低了HeLa/DDP细胞的增殖。

TGF-β/Smads信号转导通路在肿瘤的发生机制中发挥了重要作用。TGF-β超家族信号通路调控着复杂的基因表达反应，并因不同生理和病理环境而变化，其在多个水平上广泛地调节维持体内平衡。TGF-β信号通过与膜上特异性受体结合发生信号级联反应，依次激活并磷酸化胞内Smad蛋白形成TGF-β/Smad复合物，随后移入细胞核调节相关靶基因转录反应。调节过程中任何信号转导因子发生异常都可导致或促进肿瘤的发生和发展[19-20]。有研究表明，TGF-β1与宫颈癌的发生发展密切相关[21]。Smad2蛋白在宫颈癌组织中表达减少，与宫颈癌浸润程度、癌细胞分化程度密切相关[22-23]。p15基因是肿瘤抑制基因的候选基因，受细胞生长抑制蛋白TGF-β1的诱导，对细胞周期起负调控作用[24]。TGF-β1可调节周期蛋白复合物的活性并通过抗增殖机制直接诱导p15基因转录，对于细胞周期从G1期向S期进化的关键过程至关重要[25]。TGF-β1调节p15基因的表达，Smad2与Sp1合作诱导p15转录以响应TGF-β1[26]。本研究结果显示，血根碱可以明显抑制HeLa/DDP细胞TGF-β1、p-Smad/Smad和p15的蛋白表达。本研究中拯救实验还验证了血根碱对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用，认为血根碱抑制HeLa/DDP细胞的增殖可能是通过TGF-β1/Smad信号通路实现的。

综上所述，血根碱可抑制HeLa/DDP细胞的增殖，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。