LHON患者基因治疗后视功能恢复与视神经纤维层厚度关联分析

元佳佳 张勇 陈长征 杨雪莹 缪青梅 Kai Yoon Fan 李斌,

1武汉大学人民医院眼科，武汉 430065；2十堰市太和医院眼科 湖北医药学院附属医院，十堰 442000；3武汉纽福斯生物科技有限公司，武汉 420200

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种罕见的由线粒体DNA点突变引起的母系遗传病[1]，主要临床表现为急性或亚急性、同时或先后双眼视力下降至0.1以下甚至光感、视野敏感度下降及中心视野缺损。LHON常见的基因突变位点是还原型辅酶Ⅰ脱氢酶4(NADH dehydrogenase subunit 4，ND4)基因的11778(G>A)位点，引起视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)能量代谢中的呼吸链结构和功能受损、三磷酸腺苷生成受阻、细胞代谢过程能量缺乏和氧化应激，进而导致RGCs凋亡及视网膜神经纤维层(retinal nerve fiber layer，RNFL)萎缩变薄，患眼视功能明显受损[2-4]。视力下降和视野缺损是LHON主要的视功能改变表现，RNFL的变化则是LHON显著的视网膜神经组织结构改变[5-6]。按照国际临床分期标准可将LHON分为4期，其中0期为无症状期(突变携带者)；1期为亚急性期，主要在发病后6个月；2期为动态变化期，主要在发病后6～12个月；3期为慢性期，主要在发病后12个月以上[7]。本课题组前期对LHON不同分期的RNFL厚度特征研究发现，RNFL在急性期水肿逐渐加重，在慢性期和平台期视神经萎缩，RNFL变薄情况逐渐稳定[6]。目前关于基因治疗前后视功能恢复与RNFL厚度之间的关联研究较少，其对治疗后临床疗效的判定以及了解影响视力和视野恢复的因素至关重要。现阶段，LHON尚无确定有效的治疗方法。近年来LHON的基因治疗研究受到广泛关注并得到快速发展，国际上相关的临床研究工作逐渐开展[8-10]。本研究团队在2017年12月27日也启动了LHON基因治疗的临床研究，并首先在国内外报道了我国的相关临床研究结果[11-13]。但中国的相关临床研究仍属于起步阶段，基因治疗效果仍缺乏主要研究证据，尤其是患者基因治疗后视功能恢复与视网膜结构之间的关联分析。本研究进一步探索LHON基因治疗后视力和视野恢复情况与RNFL厚度之间的关联，为基因治疗LHON临床疗效的判定以及治疗方案的优化提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用开放标签、单臂多中心临床试验方法，由华中科技大学同济医学院附属同济医院、十堰市太和医院、武汉大学附属鄂州市中心医院、武汉大学人民医院以及阿根廷布宜诺斯艾利斯的佩德罗·拉格莱泽眼科医院临床医生共同开展相关研究，于2017年12月至2018年12月共招募LHON患者159例。纳入标准：(1)通过基因检测确诊为m11778G-A/MT-ND4突变的LHON患者；(2)年龄10～60岁；(3)最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)(小数视力)<0.3；(4)全身状况可以耐受一系列眼科检查及治疗，并能按时随访者。排除标准：(1)存在可能影响视神经相关视功能的其他眼部疾病，如青光眼、视神经疾病或全身性疾病；(2)基因治疗前6个月内使用过可能影响研究准确性的药物，如艾地苯醌、维生素、抗氧化剂或中药；(3)治疗前1年自然病程观察期间出现视力自发性提高的患者。159例LHON患者中男143例，女16例，包括来自阿根廷的白人男性患者10例(所有患者均为双眼患病)。患者年龄6～45岁，平均(19.2±7.2)岁；病程3～312个月。本研究方案由华中科技大学同济医学院附属同济医院(批文号：TJ-IRB20180316)、十堰市太和医院(批文号：2017-01)、鄂州市中心医院(批文号：2017-K-05)和武汉大学人民医院(批文号：WDRY2020-K202)伦理委员会根据《赫尔辛基宣言》进行审查和批准，研究实施前经Clinical Trials.gov进行临床试验注册。所有患者或授权监护人均充分了解与本研究相关的医疗诊疗过程和方案以及研究目的，并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1玻璃体腔注射 采用重组腺相关病毒2-ND4(recombinant adeno associated virus 2-ND4，rAAV2-ND4)(携带NADH-泛醌氧化还原酶亚基4基因的重组腺相关病毒)(武汉纽福斯生物科技有限公司)0.05 ml单眼玻璃体腔注射法进行治疗，药物注射眼选择BCVA较差眼，若双眼视力相同，则选择右眼为注射眼。玻璃体腔注射在手术室进行，患者取平卧位，术眼采用盐酸丙美卡因滴眼液点眼3次；常规消毒铺巾，行面部及眼部消毒；术眼用开睑器开睑，体积分数0.5%聚维酮碘消毒液冲洗结膜囊，10 s后用生理盐水冲洗；用1 ml注射器吸取0.05 ml rAAV 2-ND4(1.0×1010vg)，于注射眼顺时针7：00～8：00位角膜缘后4 mm处进针，缓慢推注药物，拔出针头后无菌棉签按压注射点2 min；术眼涂抗生素眼膏，包扎术眼。患者平卧30 min后返回病房。手术操作均由同一有经验的医师进行。

1.2.2眼科检查 所有入组患者在基因治疗前随访至少1年，在治疗前及治疗后1、3、6、12个月均分别由同一医师行BCVA、视野和RNFL厚度检查，检查者不知注射眼和非注射眼。

1.2.2.1BCVA检查 采用标准对数视力表(温州星康医疗技术有限公司)检查患者视力，受检眼与视力表距离为2.5 m，分别测定双眼视力，将BCVA转换成LogMAR视力进行统计分析。以术前末次随访BCVA作为基线视力。

1.2.2.2视野检查 采用Humphrey自动视野计(740i，德国Carl Zeiss公司)30-2中心阈值测试和SITA快速检测模式分别测定患者双眼视野。

1.2.2.3RNFL厚度测量 采用Spectralis®HRA+OCT(德国Heidelberg公司)Glaucoma-ONH模式测定视盘上方、下方、颞侧、鼻侧和平均RNFL厚度，从内界膜层到光感受器细胞层。

1.2.3终点评价指标 主要评价指标为术后视力、视野和RNFL厚度变化。(1)视力变化 以注射后第12个月BCVA改善情况作为治疗后的视力结局，视力改善定义为BCVA提高≥0.3，视力未改善定义为BCVA提高<0.3。根据注射后第12个月BCVA改善情况将患者分为注射眼视力改善组81眼、注射眼视力未改善组62眼、未注射眼视力改善组65眼和未注射眼视力未改善组78眼。(2)视野变化 以注射后第12个月的视野改善情况作为视野结局，以视野指数(visual field index，VFI)提高10%和平均偏差(mean deviation，MD)提高3 db作为改善标准，分别将患者分为注射眼VFI改善组48眼、注射眼VFI未改善组71眼、未注射眼VFI改善组47眼、未注射眼VFI未改善组72眼，以及注射眼MD改善组52眼、注射眼MD未改善组67眼、未注射眼MD改善组47眼、未注射眼MD未改善组72眼。(3)RNFL动态变化 于注射后第1、3、6、12个月进行随访，观察注射后不同时间点注射眼和未注射眼RNFL变化。(4)患者治疗后12个月视功能各指标与RNFL的关系评估。

表2 患者治疗前后视野相关指标比较(x±s)Table 2 Comparison of perimetry indicators among patients between beforeand after treatment (x±s)时间眼数VFI(%)注射眼未注射眼MD(dB)注射眼未注射眼治疗前15924.84±21.6729.73±25.69-25.00±7.54-23.31±9.32治疗后15933.98±27.2737.25±27.83-21.66±9.17-20.86±9.30t值-4.451-3.352-5.110-2.745P值<0.0010.001<0.0010.007注:(配对t检验) VFI:视野指数;MD:平均偏差Note:(Paired t test) VFI:visual field index;MD:mean deviation

表3 患者治疗前后不同时间点不同部位RNFL厚度比较(x±s,μm)Table 3 Comparison of RNFL thickness among patients at different timepoints (x±s,μm)时间眼数注射眼不同部位RNFL厚度上方下方颞侧鼻侧平均治疗前15375±3870±3635±1837±1957±38治疗后1个月14070±3066±2831±832±1650±18治疗后3个月12166±2462±2130±730±1647±14治疗后6个月11162±1860±1530±730±1445±10治疗后12个月12258±1556±1229±628±1242±9F值28.29022.93010.01023.68014.990P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001时间眼数未注射眼不同部位RNFL厚度上方下方颞侧鼻侧平均治疗前15378±3873±3736±1937±2056±26治疗后1个月14073±3568±3132±1333±1751±22治疗后3个月12168±3163±2430±931±1748±18治疗后6个月11164±2560±1930±1029±1446±18治疗后12个月12260±1856±1429±628±1243±9F值25.83024.21011.17025.25028.130P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001注:(广义线性混合模型) RNFL:视网膜神经纤维层Note:(Generalized linear mixed model) RNFL:retinal nerve fiber layer

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 视力改善者治疗前后BCVA比较

共91例患者治疗后12个月BCVA改善，占57.23%(包括注射眼和未注射眼)。治疗后注射眼BCVA较治疗前平均提高0.31±0.40，治疗前后比较差异有统计学意义(t=4.920，P<0.001)；未注射眼BCVA较治疗前平均提高0.23±0.46，治疗前后比较差异有统计学意义(t=3.550，P<0.001)(表1)。

2.2 治疗前后视野相关指标变化比较

治疗后12个月，注射眼和未注射眼VFI均明显增加，MD较治疗前均有所下降，差异均有统计学意义(t=-4.451、-5.110，均P<0.001)；未注射眼VFI较治疗前均明显增加，MD较治疗前均有所下降，差异均有统计学意义(t=-3.352、-2.745，均P<0.01)(表2)。

2.3 治疗前后患者RNFL厚度变化比较

治疗前及治疗后第1、3、6、12个月RNFL厚度见表3，治疗后RNFL厚度总体逐渐变薄。治疗前后注射眼与未注射眼不同部位的RNFL厚度比较，差异均有统计学意义(均P<0.001)。

表1 视力改善者治疗前后BCVA比较(x±s,LogMAR视力)Table 1 Comparison of BCVA between before and aftertreatment among patients with visual improvement(x±s,LogMAR visual acuity)时间眼数注射眼未注射眼治疗前1591.70±0.411.53±0.51治疗后12个月1591.37±0.551.29±0.59t值4.9203.550P值<0.001<0.001注:(配对t检验) BCVA:最佳矫正视力Note:(Paired t test) BCVA:best corrected visual acuity

表4 各组BCVA与不同部位RNFL厚度相关性分析Table 4 Correlation analysis between BCVA and RNFL thickness in four groups组别上方下方颞侧鼻侧平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼视力提高组-0.3620.003-0.2920.0190.2310.066-0.3070.014-0.3080.013注射眼视力未提高组0.0660.003-0.2230.0991.0000.341-0.2640.002-0.2790.001未注射眼视力提高组-0.1220.398-0.1110.443-0.0550.702-0.1870.194-0.1870.193未注射眼视力未提高组-0.2500.035-0.1720.150-0.1030.392-0.1410.240-0.2320.052注:(Pearson相关分析) BCVA:最佳矫正视力;RNFL:视网膜神经纤维层Note:(Pearson correlation analysis) BCVA:best corrected visual acuity;RNFL:retinal nerve fiber layer

表5 各组VFI与不同部位RNFL厚度相关性分析Table 5 Correlation analysis between VFI and RNFL thickness in four groups组别上方下方颞侧鼻侧平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼VFI提高组0.4390.0010.3560.011-0.0290.8440.2940.0380.4010.004注射眼VFI未提高组0.3010.0200.2760.033-0.1790.1720.3390.0080.3660.004未注射眼VFI提高组0.5800.0010.5240.001-0.1540.2950.5700.0010.6430.001未注射眼VFI未提高组0.2270.0790.2230.084-0.2350.0680.1310.3150.2490.053注:(Pearson相关分析) VFI:视野指数;RNFL:视网膜神经纤维层Note:(Pearson correlation analysis) VFI:visual field index;RNFL:retinal nerve fiber layer

表6 各组MD与不同部位RNFL厚度相关性分析Table 6 Correlation analysis between MD and RNFL in four groups组别上方下方颞侧鼻侧平均r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值注射眼MD提高组0.4950.0010.4240.002-0.0710.6220.3770.0070.4740.001注射眼MD未提高组0.3140.0140.2920.023-0.1850.1560.3330.0090.3770.003未注射眼MD提高组0.6010.0010.6010.001-0.1450.3270.5730.0010.6650.001未注射眼MD未提高组0.2480.0540.2430.059-0.2150.0960.1680.1950.2800.029注:(Pearson相关分析) MD:平均缺损值;RNFL:视网膜神经纤维层Note:(Pearson correlation analysis) MD:mean deviation;RNFL:retinal nerve fiber layer

2.4 治疗后患者BCVA与RNFL厚度相关性分析

注射眼视力提高组BCVA与视网膜上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈负相关(r=-0.362、-0.292、-0.307、-0.308，均P<0.05)；注射眼视力未提高组BCVA与上方RNFL厚度呈正相关(r=0.066，P=0.003)，与鼻侧、平均RNFL厚度均呈负相关(r=-0.264、-0.279，均P<0.05)。除未注射眼视力未提高组BCVA与视网膜上方RNFL呈负相关(r=-0.250,P=0.035)外，未注射眼视力提高组和未注射眼视力未提高组BCVA与其余不同部位RNFL厚度均无明显相关性(均P>0.05)(表4)。

2.5 治疗后患者VFI、MD与RNFL厚度相关性分析

注射眼VFI提高组、注射眼VFI未提高组和未注射眼VFI提高组VFI与上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈正相关(注射眼VFI提高组：r=0.439、0.356、0.294、0.401，均P<0.05；注射眼VFI未提高组：r=0.301、0.276、0.339、0.366，均P<0.05；未注射眼VFI提高组：r=0.580、0.524、0.570、0.643，均P<0.05)。未注射眼VFI未提高组VFI与RNFL厚度均无明显相关性(均P>0.05)(表5)。

注射眼MD提高组、注射眼MD未提高组和未注射眼MD提高组MD与上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈正相关(注射眼MD提高组：r=0.495、0.424、0.377、0.474，均P<0.05；注射眼MD未提高组：r=0.314、0.292、0.333、0.377，均P<0.05；未注射眼MD提高组：r=0.601、0.601、0.573、0.665，均P<0.05)。未注射眼MD未提高组MD与平均RNFL厚度呈正相关(r=0.280，P<0.05)(表6)。

3 讨论

本研究团队于2011—2012年开展了第1次基因治疗LHON的临床试验，并对9例患者术后与术前的视野改善情况进行了分析，9例患者完成术后90个月的临床随访，有6例患者视力持续提高，显示了基因治疗的长期有效性[14-17]。团队于2017年12月开展了第2次基因治疗的临床研究，共治疗了159例LHON患者，部分患者视力未提高，除年龄、病程和治疗前基线BCVA外，发现视力和视野的改善与基因治疗后的RNFL厚度存在一定的相关性[11,13]。本研究结果显示，基因治疗后注射眼视力提高组BCVA、VFI和MD与RNFL厚度呈正相关，基因治疗后RNFL越厚，视力和视野预后越好，这从侧面反映出基因治疗LHON的效果，基因治疗可以延缓视神经萎缩，保留或提高现有视力。基因治疗后的临床随访对分析基因治疗的相关性因素非常重要。

中心视力代表黄斑乳头束的视神经和视网膜功能，视野直接反映的是除黄斑乳头束之外的视神经和视网膜功能。视神经结构决定了LHON患者的BCVA和视野，基因突变导致的线粒体功能障碍可引发视神经厚度发生变化[6]。LHON患者最先出现BCVA急性降低，中心视野缺失，然后逐渐向外周扩大，其视野缺失遵循视神经丢失规律[18]。无症状期、急性期颞侧和下方象限RNFL增厚，随疾病进展，颞侧象限的RNFL逐渐变薄。慢性期视盘上方、鼻侧、下方象限的RNFL也逐渐变薄，一般在发病后1年达到稳定[19]。

基因治疗LHON的原理是rAAV2携带正常ND4基因在RGCs表达，在线粒体中转录翻译正常的ND4蛋白，从而能够源源不断地给RGCs补充所需要的能量，防止其缺乏能量而发生进一步萎缩。基因治疗后视野恢复与视神经损伤的方向相反，损伤较轻的视神经治疗后先恢复。

本研究显示注射眼视力提高与上方、下方、鼻侧和平均RNFL厚度均呈负相关，与颞侧RNFL厚度无明显相关性，这与我们认识中的黄斑乳头束RNFL厚度决定视力的观念并不一致，值得深入探讨。由于单眼注射的原则是治疗视力较差眼，如果双眼视力相同，则治疗右眼，而且治疗前注射眼的RNFL厚度较未注射眼偏薄，因此本研究结果可进一步说明基因治疗对视神经的保护作用。由于目前临床上缺乏针对RGCs形态和凋亡情况的详细检测方法，不能更加直观地检测视神经结构与视功能的关系，因此仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明元佳佳：参与选题、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章；张勇、陈长征：参与选题、实施研究、采集数据；杨雪莹、缪青梅：实施研究、收集数据、资料分析和解释；Kai Yoon Fan：数据统计分析及修改文章；李斌：参与选题和试验设计、对文章知识性内容的审阅和智力性内容的修改及定稿