表观遗传调控在视网膜变性疾病中的应用

张华 综述 庞继景 审校

1四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院，成都 610041；2沈阳何氏眼科医院遗传门诊，沈阳 110000

表观遗传是指在基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达和功能发生了可遗传的变化，并最终导致表型的变化。虽然生物遗传信息主要受DNA序列调控，但也受表观遗传修饰调控，表观遗传调控方式多样，机体中DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)调控是常见的表观遗传调控基因表达方式[1]。随着人类表观基因组计划的深入研究，表观遗传学得到了飞速发展，目前已成为生物医学研究的一个热点领域。表观遗传修饰发生在癌症、神经系统疾病、心血管系统疾病、眼部疾病等多种人类疾病[2]。广义的视网膜变性类疾病是一组以视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞等视网膜神经元变性凋亡为主要特征的致盲性眼底疾病，包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、青光眼等。表观遗传调控在视网膜变性疾病中起重要作用。本文将对主要表观遗传调控方式在视网膜变性疾病中的研究现状及未来展望做一介绍。

1 表观遗传调控机制

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，CpG二核苷酸胞嘧啶5'端共价结合1个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶的生物学过程。DNA甲基化是目前研究较深入的表观遗传调控机制之一，也是哺乳动物主要的表观遗传调控方式。机体DNA甲基化主要通过DNMT催化实现，哺乳动物主要有2类DNMT，DNMT1维持DNA甲基化酶，主要在DNA复制过程中维持DNA甲基化水平；DNMT3是重新DNA甲基化酶，主要形成新的甲基化位点。真核生物中CpG二核苷酸集中的区域称为CpG岛，CpG岛是甲基化的主要作用部位，大多数基因启动子区域含有CpG岛。DNA甲基化功能取决于CpG二核苷酸的密度及其在基因的精确位置。

组蛋白(histone，H)是染色质的最主要蛋白质组分，染色质的基本结构单元——核小体由2个H2A、2个H2B、2个H3、2个H4组成的八聚体和147 bp缠绕在外面的DNA组成。组蛋白修饰方式多样，乙酰化是目前研究较深入的组蛋白修饰方式，组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)协调进行，组蛋白乙酰化可以调节染色体组装、基因转录和翻译后修饰过程。HDAC抑制剂(HDAC inhibitor，HDACi)能引起组蛋白和非组蛋白的高乙酰化，对神经系统损伤具有神经保护作用，可以减少细胞凋亡，提高细胞存活率，调节各种神经营养因子的表达，增强抗炎反应[3]。DNA甲基化和组蛋白修饰可以相互作用，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b与HDAC2或HDAC1可以发生协同抑制作用[4]。

NcRNA是指不编码蛋白质或肽的RNA统称，主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。MiRNA是一类高度保守、长度为18～24个碱基的小ncRNA，miRNA可与靶点mRNA的3'非翻译区特异结合，进而剪切靶点mRNA并促其降解，抑制转录；lncRNA是一类长度大于200个碱基的ncRNA，可与蛋白质形成RNA-蛋白质复合体，也可与靶基因转录本形成互补链干扰mRNA剪切，主要在表观遗传、转录或转录后水平调节基因表达[5]。MiRNA和lncRNA表达异常可以引发各种病理过程，如癌症、心血管疾病、神经系统疾病及免疫系统疾病等。

2 表观遗传调控与视网膜变性疾病

2.1 DNA甲基化与视网膜变性

DNA甲基化是眼部基因表达的重要调节因子，其在基因表达调控中起着关键作用，是视网膜神经元正常发育和有丝分裂后存活所必须的。异常的甲基化模式与RP、AMD、视网膜细胞氧化应激易感性增强等多种视网膜疾病或病理基础相关[6]。DNA甲基化与遗传因素、环境因素、生活习惯密切相关，嗜烟AMD患者DNA甲基化程度明显升高[5]。

视网膜细胞程序性死亡过程中光感受器发生高甲基化，DNA甲基化改变可以调节视网膜变性过程中的基因表达[7]。视网膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B特异性敲除，引起视网膜整体甲基化水平明显降低，外丛状层变薄，外节缺失，视网膜电图(electroretinogram，ERG)异常，基因表达整体失调，光感受器细胞明显减少，突触前部和突触后部标志物表达减少[8]。DNMT1缺失引起出生后小鼠视网膜快速变性，影响视网膜神经元的生成，视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)明显减少，显著降低光感受器细胞分化和存活[9]。

RP模型rd1小鼠光感受器染色质异常，甲基化明显增加，DNMT3A表达显著升高，rd1小鼠视网膜中参与细胞死亡、存活和细胞形态及神经发育的基因高甲基化，抑制DNMTs可延缓rd1小鼠视网膜外植体光感受器细胞变性[10]。AMD患者IL17RC低甲基化，导致视网膜和血液中IL17RC蛋白和mRNA水平显著升高[11]。AMD患者DNMT1和DNMT3b表达明显增加，长散布核元件1作为老年相关疾病全局甲基化的替代标记，其甲基化水平明显升高[12]。AMD患者视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞中谷胱甘肽s-转移酶亚型mu1(glutathione S-transferase isoform mu1，GSTM1)启动子高甲基化，GSTM1和GSTM5的mRNA表达水平明显降低，GSTM1和GSTM5在RPE细胞中的表观遗传抑制可能增加AMD患者视网膜对氧化应激的敏感性[13]。

氧化应激和炎症能够降低人RPE细胞的活性，其中氧化应激可以降低人RPE细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及SIRT1的表达和DNMTs的活性，炎症可以降低DNMT1及SIRT1的表达和DNMTs及SIRT1的活性[14]。同型半胱氨酸可显著增加人RPE细胞和小鼠视网膜的DNA甲基化和组蛋白去乙酰化水平，DNMT和HDAC活性显著增强，抑制DNA甲基化和组蛋白去乙酰化可显著降低高同型半胱氨酸血症对视网膜的影响[15]。

2.2 组蛋白修饰与视网膜变性

RP、DR、青光眼、视网膜神经缺血性损伤等实验模型中均观察到组蛋白修饰的变化。组蛋白乙酰化是主要的组蛋白修饰方式，HDACi根据不同的化学结构，可以分为羟肟酸类、环肽类、苯甲酰胺类和脂肪酸类；其中视网膜变性疾病中研究较多的是脂肪酸类(如丙戊酸钠)和羟肟酸类(如曲古抑菌素A)。HDACi在神经退行性疾病的预防和治疗中起重要作用，RP小鼠模型中组蛋白乙酰化明显减少，光感受器变性之前，Ⅰ类和Ⅱ类HDAC过度激活，凝集素在AMD病理过程中起抗炎和抑制血管生成作用，HDACi可显著提高RPE细胞中凝集素的表达[16]。在视网膜疾病中，HDACi治疗可上调抗凋亡基因，如热休克蛋白70的表达，下调促凋亡基因，如凋亡蛋白酶活化因子-1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase 3)的表达，抑制蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，Erk)活化，提高细胞存活率，减少细胞凋亡过程；也可以改变神经营养因子的基因表达，进一步调节视网膜光感受器细胞的凋亡[17-19]。

丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是一种广谱HADCi，目前作为抗惊厥药物广泛使用，VPA可以改善RP患者视野，延缓视力下降[17]，也可以抑制AMD血管生成和炎症反应[16]。大量研究表明VPA对RGC具有保护作用[3]。VPA通过刺激神经元TrkB受体信号阻止N-甲基-D-天门冬胺酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)诱导的RGC死亡、视网膜变性及视觉功能损伤[20]。谷氨酸/天冬氨酸转运体基因缺失的小鼠在不升高眼压的情况下发生进行性RGC凋亡和视神经变性，表现为青光眼特征，VPA治疗可抑制此过程，改善视觉损伤，降低氧化应激水平[21]。在缺血-再灌注大鼠模型中，VPA可减轻视网膜神经元凋亡及RGC轴突损伤[18]。大鼠视神经损伤后，VPA治疗可以增加RGC存活率和pERK1/2的表达，抑制caspase 3活性；也可以激活脑源性神经营养因子和TrkB信号，抑制RGC凋亡[19,22]。

曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是一种羟肟酸类，可以抑制类型Ⅰ和Ⅱ HDAC，是视网膜疾病中研究较多的HDACi之一。TSA可以调节rd1小鼠过氧化物酶体增生物激活受体活性，减少rd1小鼠光感受器变性[23]；可以显著增加cpfl1小鼠视锥光感受器存活率，抑制其变性[24]；可以延缓缺血-再灌注损伤模型视网膜厚度变薄，提高RGC存活率，减少RGC变性[25]；可以减少缺血导致的视网膜内层变性，改善ERG a波和b波振幅，降低肿瘤坏死因子α的表达[26]。脉络膜新生血管是AMD的一种致盲性并发症，TSA可以抑制脉络膜新生血管生成。此外，TSA可以抑制RPE细胞在G1期的细胞周期进程进而抑制RPE细胞的增生，促进RPE细胞对纤粘蛋白的黏附，抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)诱导的RPE细胞迁移及转化生长因子β诱导的α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，下调促血管生成的缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，上调抗血管生成和保护神经的血小板源性生长因子的表达，进而抑制新生血管生成[27]。

其他HDACi也具有广泛的神经保护作用。丁酸钠(sodium butyrate，NaB)广泛用作动物饲料添加剂，在预防和治疗神经退行性疾病方面发挥着重要作用。大鼠视神经损伤后，NaB治疗可促进RGC存活，增加ERG反应，上调Akt和Erk的磷酸化水平，增加组蛋白H3K14的乙酰化水平[19]。Ms-275是一种合成的苯甲酰胺衍生物，选择性抑制HDAC1、2和3，对小鼠视神经损伤后RGC的分化和存活具有保护作用[28]。

2.3 NcRNA与视网膜变性

NcRNA在视网膜发育及视网膜相关疾病的发生和发展过程中起重要作用。在RP、AMD、DR、眼部炎症、病理性血管生成等病变中，特异性miRNA的表达水平发生改变[6]。Rd10小鼠杆体中磷酸二酯酶基因β亚基(β subunit of the rod phosphodiesterase gene，Pde6g)第13个外显子发生自发突变，引起大量miRNA变化显著，1 900多个miRNA中，152个在rd10小鼠视网膜中差异表达，在变化最显著的19个miRNA中，7个miRNA与视网膜营养不良有关，其中miR-3473b、miR-7035-5p和miR-762对应Pde6g的靶点[29]。淀粉样-β低聚物可引起视网膜变性，其miRNA图谱中61个miRNA变化显著[30]。AMD的确切病因尚不清楚，目前较认可的分子机制有炎症、氧化应激和病理性新生血管生成[31]。MiRNA在AMD免疫炎症反应、氧化应激反应、病理性血管生成等多种生理病理过程发挥重要作用，miR-133、miR-222、miR-889、miR-4258等可以调节多种生长因子，miR-20、miR-23、miR-24、miR-103等可以调节多种血管生成因子，miR-9、miR-146、miR-155、miR-661、miR-3121等可以调节炎症反应，进而调控AMD的发生及发展过程[32]。AMD患者视网膜中miR-9、miR-125b、miR-146a、miR-155上调，可导致补体因子H和炎症调节改变，进而导致与炎症和AMD相关的巨噬细胞数量、位置和表型的改变[31]。MiR-25、miR-184等参与氧化应激反应，氧化应激可提高miR-25的表达，进而抑制整合素αV和PEDF的表达，导致RPE吞噬功能紊乱，引起RPE凋亡和视力损害[33]；抑制miR-184可提高RPE细胞ezrin蛋白的水平，也可导致溶酶体相关膜蛋白1下调，降低RPE吞噬功能[34]。AMD与缺氧密切相关，AMD患者HIF-1明显上调，HIF-1可以活化VEGF的表达。MiR-17可以调节HIF-1和VEGF的基因表达；AMD患者玻璃体液中miR-152下调，miR-152可以调节VEGF的表达；miR-126是维持血管结构的必要条件；miR-150可以调节细胞迁移、增生和成管过程[31,33,35]。MiRNA目前已成为AMD的潜在治疗靶点，其中，miR-889、miR-4258、miR-661、miR-3121等可能成为临床上AMD的生物学标志物[32]。

相对于miRNA，lncRNA在视网膜变性疾病中的研究正处于起步阶段，lncRNA可影响视网膜发育并参与视网膜变性疾病的发生和发展。LncRNA也调节AMD进程，早期AMD患者中共有266个差异表达基因，其中64个是lncRNA，RP11-234O6.2可以调节老化RPE细胞功能，早期AMD中RP11-234O6.2表达下调，外源性RP11-234O6.2可提高RPE细胞的存活率[36]。对lncRNA母体表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)的抑制可以治疗光诱导引起的视网膜变性，光诱导后，MEG3表达显著上调，MEG3沉默可降低促凋亡的caspase 3和caspase 7活性，上调抗凋亡的bcl-2表达，进而抑制光诱导引起的光感受器细胞凋亡[37]。MEG3也参与糖尿病相关的微血管功能障碍，MEG3敲除可增加毛细血管变性和炎症，加重视网膜血管功能障碍，体外实验中，MEG3敲除可以增加视网膜内皮细胞的增生、迁移和成管[38]。LncRNA ZNF503-AS1位于RPE细胞胞浆中，可以促进RPE细胞分化，抑制RPE细胞增生和迁移；ZNF503-AS1由ZNF503反义转录而来，可以抑制ZNF503表达，而ZNF503可抑制RPE细胞分化，促进RPE细胞增生和迁移[39]。

3 总结与展望

视网膜变性是致盲的主要原因之一，其发病机制比较复杂。上世纪80年代以前，一般把原因不明的视网膜变性，如RP称为原发性或特发性变性，用以和有较明确诱因的其他视网膜变性，如AMD等相区别。在过去的30多年里，随着分子生物学和分子遗传学的进展，大多数原因不明的原发性视网膜变性被发现和基因突变及由此而产生的功能性蛋白缺失有关；这类疾病现在也叫遗传性视网膜变性。虽然每年都有造成视网膜变性的新突变基因被发现，仍有20%以上的这类临床表现相似的病人在基因层面找不到致病原因。近年来的研究发现在这些病例中，有一些即使基因的核苷酸序列不发生突变，其基因的表达和功能也能发生可遗传的改变，并最终导致表型的变化，引起疾病，这是表观遗传学的基础。

目前研究证实多种因素可以影响视网膜变性的进程。在所有类型的视网膜变性，包括由基因或者其表达问题造成的遗传性视网膜变性、环境和/或遗传等多因素造成的视网膜变性(AMD、青光眼、DR等)中均可能发生DNA甲基化、组蛋白乙酰化、ncRNA表达障碍等表观遗传变化；某些表观遗传药物，如SAHA等临床试验也在进行中。表观遗传调控可以改善视网膜基因表达，促进细胞分化与存活，减少细胞凋亡，抑制炎症反应及血管生成，减少光感受器变性。然而表观遗传调控治疗突变基因明确的遗传性视网膜变性疾病尚不是首选，因为单纯表观遗传调控很难彻底改善由基因突变造成的蛋白缺失，需要借助基因治疗等手段达到彻底纠正病因的目的[40]。其次，表观遗传影响或调控视网膜变性的发病机制尚不完全清楚，其在视网膜凋亡、氧化应激、炎症、新生血管生成等方面的研究较浅，机制方面有待进一步阐明。再次，表观遗传存在交互调控现象，DNA甲基化和组蛋白修饰相互作用引起转录激活或沉默[4,41]，改变一种表观遗传调控方式，可以引起另一种表观遗传调控方式代偿性的改变，这给视网膜变性疾病的治疗带来不确定因素。表观遗传交互调控视网膜变性疾病的关键靶点筛选是治疗的关键所在，同时，表观遗传药物大多缺乏特异性，这样无法有针对性地进行靶向治疗。尽管表观遗传调控视网膜变性有待于更充分的探索，但表观遗传失调显然是视网膜变性的重要原因之一，表观遗传调控可能是多因素造成的视网膜变性疾病的有效治疗手段，也是对不适合基因替代疗法的这类患者在治疗方法上的补充。

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