中国汉族Wagner综合征一家系临床与分子遗传学研究

蔡素萍 张达人 罗小玲 黄龙翔 王婷婷 许婷婷 刘旭阳,

1暨南大学附属深圳眼科医院，深圳 518040；2厦门大学附属厦门眼科中心，厦门 361016；3深圳市人民医院眼科 暨南大学第二临床医学院，深圳 518020；4福建医科大学附属第一医院眼科，福州 350005；5四川大学华西厦门医院眼科，厦门 361021

Wagner综合征是一种少见的遗传性玻璃体视网膜疾病，以玻璃体空腔，玻璃体腔内条带状、膜状或网纱状增生牵引为主要临床表现，可继发视网膜脱离、脉络膜视网膜萎缩、进行性夜盲、近视及早发白内障，其中进行性脉络膜视网膜萎缩和继发性视网膜脱离是引起视力严重下降的主要原因[1]。VCAN基因变异可引起Wagner综合征，遗传方式为常染色体显性遗传。VCAN基因编码的Versican蛋白是一种硫酸软骨素蛋白聚糖，在胚胎发育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，说明其致病机制为VCAN基因功能缺失[2-3]。目前国内尚未见Wagner综合征病例及家系报道，本研究对中国汉族Wagner综合征一家系的临床表现及分子遗传学特点进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

家系信息采集自厦门大学附属厦门眼科中心和福建医科大学附属第一医院眼科。采用家系调查研究方法，于2020年1月在厦门大学附属厦门眼科中心收集中国汉族Wagner综合征一家系共3代13名成员，其中确诊患者共5例。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经厦门大学附属厦门眼科中心医学伦理委员会批准(批文号：MR-35-22-002800)，所有受检者均充分了解本研究目的并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1全身及眼科检查 详细询问所有受试者病史，全身检查包括口面部、骨骼、关节、肌肉及听力检查；眼科检查包括裸眼视力和最佳矫正视力(国际标准视力表)、非接触式眼压计(TX-20，日本佳能公司)测量受试者眼压，裂隙灯显微镜检查眼前节情况，直接检眼镜、眼底照相(Visucam524，德国Carl Zeiss公司)、广角眼底照相(欧宝200，德国欧宝公司)、光相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)(AngioPlexTMCirrus HD-OCT 5000，德国Carl Zeiss公司)检查眼底情况，超声生物显微镜(ultrasound biomicroscope，UBM)(法国光太公司)检查眼前节及房角情况等，家系中已故成员病历资料由其子女提供。

1.2.2分子遗传学分析 基因检测及分子遗传学分析由暨南大学附属深圳眼科医院、深圳市人民医院、四川大学华西厦门医院共同完成。采用HaploPainter软件绘制家系图，并进行系谱分析。采集受试者2 ml外周静脉血于EDTA抗凝管中，提取基因组DNA样本后，由上海韦翰斯生物医药科技公司对先证者DNA使用高通量目标区域捕获测序进行检测，芯片包含已知玻璃体视网膜疾病的386个基因，针对筛选出的变异位点，对该家系中其他家庭成员进行共分离验证。采用美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南对变异位点进行评分，通过蛋白结构和功能预测网站PredictProtein(https://predictprotein.org)对VCAN结构和功能进行预测。

2 结果

2.1 Wagner家系遗传方式及特点

该家系符合Wagner综合征临床诊断者共5例(表1)，各代均有发病，其中男3例，女2例，1例已去世，表型正常者8人。家系中无近亲结婚史，且3代连续发病；男女患者发病概率无明显差别；患者双亲中必有一方患病；若父母双方均未患病，所有子女均不患病。该家系遗传模式符合常染色体显性遗传(图1)。

表1 Wagner综合征家系患者表现型分析Table 1 Phenotype analysis of patients from a Wagner syndrome family患者确诊年龄(岁)视力(右眼/左眼)眼部主要表现是否手术突变位点类型Ⅱ-352均为手动/眼前早发白内障、人工晶状体脱位、玻璃体浓缩、视网膜面纱样增生膜、色素沉着、视网膜脉络膜萎缩,虹膜无前后粘连,无明显色素脱失,无明显房水闪辉,KP(-)是c.9265+1G>A杂合Ⅱ-551无光感/0.6早发白内障、视网膜面纱样增生膜、色素沉着、视网膜脱离及黄斑水肿是c.9265+1G>A杂合Ⅲ-1260.1/0.25前房浅(约1/4 CT)、视网膜面纱样增生膜、色素沉着、视网膜脉络膜萎缩是c.9265+1G>A杂合Ⅲ-220未查前房浅(约1/4 CT)、眼底色素沉着否c.9265+1G>A杂合注:KP:角膜后沉着物;CT:角膜厚度Note:KP:keratic precipitate;CT:corneal thickness

图1 Wagner综合征家系图 □：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；/：已故；：先证者Figure 1 Pedigree of a Chinese family with Wagner syndrome □:normal male;○:normal female;■:affected male;●:affected female;/:deceased;:proband

2.2 Wagner综合征家系患者表型特征

先证者Ⅱ-3，男，52岁，双眼人工晶状体脱位。先证者女儿Ⅲ-1自幼双眼视力差，伴有夜盲，曾因双眼急性闭角型青光眼(右眼急性发作期，左眼临床前期)在当地医院行药物降眼压治疗。先证者儿子Ⅲ-2夜间视力差，暂未出现其他眼部症状。该家系所有患者均无全身病史和全身异常表现，眼部病变具有以下特点：(1)前房浅(约1/4 CT)，有闭角型青光眼的发病趋势。先证者及其胞弟Ⅱ-5已行白内障手术，其前房状况不能反映真实情况，先证者女儿Ⅲ-1和儿子Ⅲ-2双眼前房浅(图2)；(2)悬韧带异常，玻璃体浓缩。先证者扩瞳后可见双眼人工晶状体向下方移位，上方悬韧带稀疏，瞳孔区可见浓缩的玻璃体(图3)；(3)白内障发病年龄早。家系中先证者及其胞弟Ⅱ-5在约40岁时已有明显白内障，因二人均已行白内障手术，故无影像学资料；(4)视网膜牵拉膜形成。先证者及其女Ⅲ-1眼底均可见明显的视网膜面纱样增生膜形成，先证者胞弟Ⅱ-5曾因视网膜脱离行手术治疗，眼底可见增生膜形成，牵拉视网膜，引起神经上皮脱离，黄斑水肿(图4)；(5)视网膜脉络膜萎缩。先证者及其女Ⅲ-1眼后节OCT均可见明显视网膜脉络膜萎缩变薄(图5)；(6)眼底色素沉着。先证者及其胞弟Ⅱ-5、其女Ⅲ-1、其子Ⅲ-2双眼底均可见不同程度色素沉着；(7)先证者瞳孔欠圆，但无葡萄膜炎病史，虹膜无前后粘连及明显色素脱失，无明显房水闪辉，KP(-)。

图2 患者Ⅲ-1和Ⅲ-2双眼眼前节照相 显示双眼前房浅 A：患者Ⅲ-1右眼 B：患者Ⅲ-1左眼 C：患者Ⅲ-2右眼 D：患者Ⅲ-2左眼 图3 先证者Ⅱ-3左眼眼前节照相 A：人工晶状体向下方移位 B：上方悬韧带稀疏，瞳孔区可见浓缩的玻璃体机化膜Figure 2 Anterior segment images of both eyes of patients Ⅲ-1 and Ⅲ-2 Anterior chambers were shallow A:right eye of Ⅲ-1 B:left eye of Ⅲ-1 C:right eye of Ⅲ-2 D:left eye of Ⅲ-2 Figure 3 Photograph of the left anterior segment of the proband Ⅱ-3 A:The intraocular lens shifted downward B:The upper suspensory ligament was sparse,and the condensation of organized vitreous membrane was observed in pupil area

图6 Wagner综合征患者VCAN基因序列片段 该家系中所有患者VCAN基因上发现1个杂合经典剪接位点变异c.9265+1G>A，如红色方框及红色箭头所示Figure 6 VCAN gene sequence fragment of patients with Wagner syndrome A heterozygous canonical splicing site variant c.9265+1G>A was found in the VCAN gene of all patients in the family,as shown by the red box and red arrow

图4 先证者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1彩色眼底照相 先证者及其女儿Ⅲ-1双眼眼底均可见明显的视网膜面纱样增生膜(箭头)形成及色素沉着；先证者胞弟Ⅱ-5左眼眼底可见增生膜(箭头)形成及色素沉着 A：先证者右眼 B：先证者左眼 C：先证者女儿Ⅲ-1右眼 D：先证者女儿Ⅲ-1左眼 E：先证者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 4 Color fundus images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Obvious retinal veil-like proliferative membrane (arrow) was observed in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1,and pigmentation was seen in their fundus.The proliferative membrane (arrow) and pigmentation was observable in the fundus of the left eye of the proband's younger brother Ⅱ-5 A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

图5 先证者及患者Ⅱ-5、Ⅲ-1黄斑OCT图像 先证者及其女儿Ⅲ-1均可见双眼视网膜及脉络膜明显萎缩变薄；先证者胞弟Ⅱ-5左眼眼底增生膜牵拉视网膜引起神经上皮脱离及黄斑水肿 A：先证者右眼 B：先证者左眼 C：先证者女儿Ⅲ-1右眼 D：先证者女儿Ⅲ-1左眼 E：先证者胞弟Ⅱ-5左眼Figure 5 Macular OCT images of proband and patients Ⅱ-5,Ⅲ-1 Significant atrophy and thinning of the retina and choroid were seen in both eyes of the proband and his daughter Ⅲ-1.Proliferative membrane was observed in the fundus of left eye of Ⅱ-5,the proband's younger brother,stretching the retina and causing neuroepithelial detachment and macular edema A:right eye of proband B:left eye of proband C:right eye of proband's daughter Ⅲ-1 D:left eye of proband's daughter Ⅲ-1 E:left eye of proband's younger brother Ⅱ-5

2.3 基因测序

高通量目标区域捕获测序和Sanger测序发现该家系中VCAN基因上的1个杂合经典剪接位点变异c.9265+1G>A，该变异与疾病共分离(图6)。该变异为罕见变异，目前已有文献报道在Wagner综合征型玻璃体视网膜病变患者中检测到该变异，相关信息已被收录在人类基因突变数据库和Clinvar数据库中，在千人基因组、ExAC、gnomAD数据库中均未收录该变异，ACMG评级为PM2。该变异为经典剪接变异，可能导致该基因的功能缺失，ACMG评级为PVS1。参照ACMG指南，该变异为可能致病性变异。该变异位于剪切位点，通过蛋白质功能预测，其碱基对取代可引起截短1 754个氨基酸的蛋白质产物形成，导致单倍体剂量不足，糖胺聚糖附着位点严重减少，使Versican蛋白功能出现异常。

3 讨论

本研究中通过对家系成员详细的临床检查发现，该Wagner综合征家系的眼部病变共同特征包括悬韧带异常、早发白内障、玻璃体空腔、玻璃体浓缩、玻璃体腔中面纱状增生膜、视网膜脉络膜萎缩变薄、牵拉性视网膜脱离、视网膜色素沉着。先证者白内障术后出现双眼人工晶状体脱位，部分患者还存在浅前房等闭角型青光眼的发病诱因。Wagner综合征的症状通常在青春期出现，但也可以在幼年时期开始。除该家系所表现出的临床特征外，有研究者报道部分Wagner综合征患者还可出现因黄斑牵拉引起位移产生假性斜视外观、小眼症、虹膜萎缩和原始玻璃体持续增生等临床表现[4-5]。

Stickler综合征是一种结缔组织疾病，其眼部特征与Wagner综合征类似，都存在较典型的玻璃体凝胶结构异常和视网膜改变，不同的是，Wagner综合征没有全身系统性病变，而Stickler综合征可合并关节、颌面部及听力损伤等全身异常[6-7]。但常见的1型Stickler综合征多数仅有眼部异常表现[8]，在临床上不易与Wagner综合征区分，需进一步行遗传学检查加以鉴别。Wagner综合征与Stickler综合征在遗传学方面有明显区别，前者是由于位于染色体5q的VCAN基因变异导致，几乎完全外显[9]，后者则由于位于染色体12q的胶原合成相关基因变异导致，遗传方式也较为多样，最常见的是由COL2A1基因变异引起[10]，还可见于COL11A1、COL11A2、COL9A1、COL9A2及COL9A3等基因[11-14]。Wagner综合征还需与Jansen综合征及侵蚀性玻璃体视网膜病变综合征相鉴别。Jansen综合征常见临床表现为视网膜脱离[15]，侵蚀性玻璃体视网膜病变除了与Wagner综合征有相似的临床表现外，由于脉络膜视网膜萎缩更明显，可引起进行性夜盲和向心性视野缩窄[16]。

Wagner综合征由VCAN基因变异引起。VCAN有15个外显子，编码一种具有3 396个氨基酸的大型硫酸软骨素蛋白聚糖Versican。Versican蛋白在胚胎发育中起重要作用，VCAN基因敲除的小鼠在胚胎期致死，说明其致病机制为VCAN基因的功能缺失。Versican是一种细胞外基质蛋白，是玻璃体的组成部分，参与维持玻璃体结构的完整性[17]。已知Versican的4种转录物/同工型蛋白质分别是包含2个外显子的V0(NM004385.4)、缺乏外显子7的V1(NM001164097)、缺乏外显子8的V2(NM001164098)和缺乏外显子7及外显子8的V3(NM001126336)[18]，由外显子7和外显子8的可变剪接产生，并且在许多组织中表达，其中包括眼组织[18-19]。这2个外显子包含糖胺聚糖附着位点，可支持硫酸软骨素侧链聚集。糖胺聚糖残基在翻译后与外显子7和外显子8编码的蛋白质结构域相连，这些残基参与了玻璃体凝胶的形成[17]。迄今为止，所有已被报道的Wagner综合征患者基因变异均影响了VCAN基因的保守内含子7受体剪接位点或内含子8的供体剪接位点[18,20-26]。

目前尚无研究表明Versican在晶状体内表达，但在多个不同VCAN变异位点的Wagner综合征研究报道中均存在白内障[1-3]，而在国外与本研究相同的c.9265+1G>A杂合突变家系中亦存在白内障这一表型[25-26]，且该突变与表型共分离，因此可认为本研究中早发白内障这一表型与VCAN变异密切相关。该家系基因分析并未发现与Wagner综合征及早发白内障这一表型共分离的其他变异位点。因此，目前尚无其他证据提示本病是由于其他基因变异引起的早发白内障。然而，也不排除白内障表型与VCAN基因相关其他基因变异有关的可能性，亦有可能由于玻璃体异常导致了继发性晶状体发育异常，值得深入研究。

目前虽然尚不能完全解释Wagner综合征的确切分子发病机制，但很明显其涉及剪接。内含子7剪接受体位点变异可以激活21个碱基对的隐蔽剪接位点，使其成为外显子8的异常转录本[18,20,24]，有研究报道在携带c.9265+1G>A变异的Wagner综合征患者的血液中能够发现少量该异常转录本[21]。本研究首次在中国汉族一家系中确定了VCAN基因c.9265+1G>A变异是该Wagner综合征分子遗传学上的致病原因，定位在外显子8侧翼的保守剪接位点，并推断该基因产生变异后持续降低剪接位点的作用强度，从而促进外显子产生的同工型蛋白V2亚型增加。此前有研究表明，在剪接受体位点(c.4004-1、-2和-5)变异的Wagner综合征患者V2表达可增加80倍，能够进一步支持这一观点[20,22]。V2蛋白具有相当数量的侧链，因此，进一步探讨V2蛋白侧链的功能及相互作用有助于解释该家系眼部表型的机制，如高发病率的视网膜脱离或容易引起视网膜脱离的周边部视网膜病变，以及进行性的视网膜脉络膜萎缩导致视力严重下降及视功能障碍。本研究家系具有玻璃体浓缩、视网膜增生及牵拉、黄斑病变、视网膜脉络膜萎缩等Wagner综合征的较典型临床表型，与国外对该病c.9265+1G>A这一变异位点的相关研究结果比较[25-26]，本研究中Wagner综合征家系的眼前节相关症状及体征，如浅前房及伴发急性闭角型青光眼、早发白内障及悬韧带异常、晶状体脱位等相关表型未见报道。本研究于国内首次报道了中国汉族Wagner综合征一家系的VCAN基因变异，为该疾病家系临床表型及基因变异位点提供了更多的数据，对指导Wagner综合征的诊断具有一定意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明蔡素萍：酝酿和设计试验、实施研究、起草及修改文章；张达人、王婷婷：实施研究、采集数据、起草文章；罗小玲：修改文章；黄龙翔：分析和解释数据、起草文章；许婷婷：采集数据、起草文章；刘旭阳：酝酿和设计试验、指导试验、对文章的知识性内容作批评性审阅及定稿