中药及提取物抗溃疡性结肠炎肠上皮细胞凋亡作用机制研究进展

陈婷 肖慧荣 蔡弘 肖亚婧

（1江西中医药大学2020级硕士研究生 南昌 330004；2江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis,UC）是一种全球性、难治性炎症性肠道疾病。UC的确切病因尚不明确，但随着研究的深入，人们已经充分认识到其发病是由异常免疫反应介导，其特征是免疫细胞的强大激活、炎症级联和黏附分子的产生，造成肠道上皮受损及功能紊乱[1]。近来众多研究表明，肠道上皮细胞（Intestinal Epithelial Cells,IEC）的异常凋亡在UC发病中有着重要作用。IEC过度凋亡使肠上皮通透性增高、黏膜屏障损伤，继而在多因素作用下激发过度的免疫应答，最终引起失控的炎症反应和黏膜的持续性损伤[2]。因此，有效抑制IEC过度凋亡对UC的临床治疗具有关键意义。本文就中药及提取物抗肠上皮细胞凋亡的途径进行综述，以期阐明其抗肠上皮细胞凋亡的作用机制，同时希望启发新的治疗策略。现报道如下：

1 肠上皮细胞凋亡与UC关系

肠上皮屏障是一个由紧密连接的上皮细胞组成的虚拟壁，分泌黏液、蛋白酶、激素和免疫介质，它限制了微生物组和免疫系统之间的相互作用，在抵御肠道异常免疫应答中起着重要作用[3]。IEC不仅控制消化过程，而且形成一个物理屏障来保护宿主。位于营养物质和复杂的微生物生态系统的界面上，IEC有效阻挡了腔内抗原的吸收及黏膜微生物的入侵，对维持肠黏膜屏障功能稳定性至关重要[4]。肠道黏膜结构是由上皮细胞的增殖和凋亡这两者间的生理平衡来维持的。在应对微生物入侵时，IEC发生死亡以维持肠上皮功能，并保持持续更新和组织稳态。当这个生理平衡被打破时，细胞凋亡的速度远快于代偿性增殖，就会导致紧密连接上皮层的缺失，破坏肠道黏膜屏障[5]。此时，肠腔内各类抗原将过度暴露于黏膜固有层，通过激活相关炎症细胞通路，增加促炎因子释放，产生级联炎症反应和持续性黏膜损伤[3]。

2 肠上皮细胞凋亡途径及中药和提取物的干预作用

2.1 死亡受体介导途径 死亡受体通路是细胞凋亡的外在途径。死亡受体（Death Receptor,DR）是一类细胞表面表达的Ⅰ型跨膜受体，构成了肿瘤坏死因子受体超家族的一部分，对于免疫调节、细胞增殖、凋亡和形态发生等至关重要[6]。这类受体包括肿瘤 坏 死 因 子 受 体1（TNFR1）、CD95（又 称Fas/APO-1）、肿瘤坏死因子（TNF）相关的细胞凋亡诱导配体（TRAIL）-R1（又称DR4）、TRAIL-R2（又称DR5/APO-2）以及DR3（TRAMP）等[7]。死亡受体-配体系统诱导细胞的程序性死亡-细胞凋亡。同源受配体结合可以招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白（TRADD），形成复杂的死亡诱导信号复合物，进而作用于下游效应分子-半胱天冬氨酸蛋白酶家族中的Caspase-8，通过活化的Caspase-8启动关键的细胞凋亡执行者Caspase-3，酶解结构蛋白并裂解DNA相关修复分子等，导致DNA片段切割和凋亡小体形成这一凋亡反应级联[8]。主要通过TNF-TNFR1、Fas-FasL和TRAIL-TRAILR1/2这3条信号途径介导细胞凋亡。其中Fas-FasL介导途径与肠上皮细胞凋亡密切相关，且UC黏膜Fas及FasL的高表达与疾病活动性成正相关[9]。

大量研究证实中药及中药的提取物能有效阻断Fas-FasL途径诱导的IEC过度凋亡，改善肠黏膜溃疡和炎症损伤，可能通过下调FADD、Fas-FasL和Caspase-3来实现。雷公藤的有效成分雷公藤多苷是具有抗炎、抗免疫的天然提取物。杨强等[9]通过Real-time PCR检测Fas/FasL，证实雷公藤多苷能抑制UC大鼠结肠黏膜的Fas、FasL蛋白表达，同时调控p38 MAPK信号通路，通过抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等致炎因子释放，改善UC炎症和黏膜损伤。闫曙光等[10]研究表明乌梅丸方通过降低结肠上皮Fas、FasL mRNA以及Caspase-3的表达来抑制IEC过度凋亡。曹思齐等[11]研究发现芍药汤对湿热型UC大鼠结肠黏膜表达FADD、Caspase-8 mRNA及蛋白有明显抑制作用，可延缓IEC的凋亡。

2.2 线粒体介导途径 线粒体介导途径是内在凋亡通路。线粒体的功能和代谢决定和调节IEC特性，如分化状态、增殖和凋亡。不同刺激引起线粒体膜电位降低，致使膜通透性增加。线粒体膜通透性增加引起细胞质内细胞色素C（Cytochrome C,Cyt-C）的释放，是该途径中的一个关键环节。Cyt-C通过与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，并利用ATP/dATP介导的前体蛋白Procaspase-9诱导形成Caspase-9，随后启动刽子手Caspase-3引起细胞凋亡[12]。线粒体跨膜电位的改变由线粒体膜上的复合通道-线粒体通透性转变孔（MPTP）的开放和作用于线粒体膜磷脂的B细胞淋巴瘤（Bcl）-2基因家族调控线粒体膜通透性决定。具体体现在两方面：一是MPTP持续开放导致的跨膜电位消失；二是Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡蛋白之间的平衡失调，使得线粒体膜通透性升高，跨膜电位降低。Bcl-2家族促凋亡蛋白，包括Bid、Bax、Bak、Bad、Bim，作用于线粒体膜增加其通透性，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL则拮抗促凋亡蛋白，起到稳定线粒体膜作用[13]。另外，有研究显示线粒体自噬可清除线粒体损伤带来的黏膜伤害。线粒体损伤后，活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）被释放，过量的ROS激活炎性小体NLRP3，进一步刺激促炎因子IL-1β、白细胞介素-18（IL-18）分泌并发生由Caspase-1诱导的细胞凋亡[14]。线粒体自噬途径则可清除发生功能障碍的线粒体，调控NLRP3介导的炎性反应和上皮损伤，其主要通过PINK1-Parkin、BNIP3-NIX和FUNDC1介导的经典信号通路实现[15]。

丹参醇是来源于中药丹参的一种天然产物，研究证实其可明显降低Bax及Caspase-3、Caspase-9在大肠黏膜系的表达，同时降低促炎因子白细胞介素-6（IL-6）、TNF-α等的浓度，减轻IEC凋亡和炎症反应[16]。中药复方左金丸通过上调Bcl-2、下调Bax和Caspase-3蛋白表达抑制肠上皮的过度凋亡，并调节辅助性T细胞与调节性T细胞的平衡，进一步减轻炎症反应和黏膜损伤[17]。此外，中药调控线粒体自噬途径治疗UC也取得不错疗效。刘宇等[18]研究发现彝药翻白草可提高急性UC小鼠线粒体自噬基因转录因子核因子（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）、p62、parkin的表达，促进IEC线粒体自噬途径及下调炎性细胞因子，从而抑制NLRP3的活化，发挥修复肠黏膜的作用。苗金雪等[19]通过动物实验研究发现黄芩汤可调控PINK1-Parkin通路激活线粒体自噬，从而缓解肠道炎症损害。

2.3 内质网应激介导途径 内质网是加工和转运蛋白质的主要细胞器。不同细胞应激状态可导致内质网腔内蛋白质无法折叠或错误折叠，积累一定量后会产生内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS），并触发一种适应性的保护反应-未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response,UPR）。UPR通过减少未折叠或错误折叠蛋白的积累，恢复正常的内质网功能，从而维持细胞内稳态。这一代偿机制可通过上调ERS激发的标志蛋白-葡萄糖调节蛋白78（GRP78，又称Bip）的表达，触发下游三条信号通路-肌醇需求酶1α-X框结合蛋白1（IRE1α-XBP1）、蛋白激酶R样内质网激酶-真核细胞翻译起始因子2α（PERK-eIF2α）和活化转录因子6（ATF6）途径来实现[20]。然而过量UPR引发剧烈的内质网应激，触发细胞凋亡。可能通过以下途径实现[21]：（1）PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径。ERS发生使PERK与GRP78分离，进入PERK-eIF2α途径意图减少未折叠和错误折叠蛋白，再通过活化转录因子ATF4进一步转录形成C/EBP同源蛋白（CHOP）调控凋亡相关通路-死亡受体通路和线粒体通路触发细胞凋亡。（2）IRElα-TRAF2-ASK1-JNK途径。长时间、过量的ERS活化IRE1α并与TNF受体相关因子2（TRAF2）特异性结合，激活凋亡信号调节激酶1（ASK1）使得c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化，继而促进线粒体促凋亡蛋白Bax、Bid、Bim的增加以及触发死亡受体途径，诱导细胞凋亡。（3）Caspase-12途径。前体蛋白Procaspase-12预先位于内质网的细胞质侧，可在ERS的作用下被裂解活化成Caspase-12，进一步激活Caspase-9和Caspase-7，最后由Caspase-3执行细胞凋亡。

罗敏等[22]通过TNBS灌肠法造模UC小鼠，发现模型小鼠p-PERK蛋白及p-PERK mRNA表达明显高于空白组，说明TNBS刺激会引发ERS诱导其高表达。而在持续给予芍药汤灌胃14 d后发现大鼠结肠组织表达p-PERK蛋白及其mRNA降低，疾病活动指数也显著降低，说明芍药汤可能通过抑制ERS中由PERK介导的凋亡通路改善UC。青蒿琥酯作为一种青蒿素衍生物，可抑制ERS过度激活，通过降低GRP78、CHOP、Cleaved-Caspase-3以及上调Bcl-2/Bax来抑制IEC凋亡，具体与抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和IRE1α-XBP1信 号 通路相关[23]。沈雁等[24]采用过氧化氢（H2O2）刺激法造模ERS小鼠，再用DSS法造模成UC小鼠，其结肠组织表达GRP78、Caspase-12和Caspase-3较正常组高，甘草酸苷干预后以上凋亡蛋白均降低，结肠上皮细胞凋亡率下降，有效缓解了黏膜炎症损伤。综上说明ERS介导的凋亡途径是不错的干预靶点。

2.4 MAPK介导途径 丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPK）的经典家族成员包括细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK1/2/3）和ERK5信号通路，它们在将细胞外刺激转化为广泛的细胞反应中发挥重要作用，如细胞增殖和分化、衰老和凋亡[25]。其导致细胞增殖还是凋亡取决于应激刺激和参与这种激活的细胞类型。在一些转录因子如激活蛋白1（AP-1）以及p53肿瘤抑制蛋白的作用下，应激激活的JNK和p38MAPK信号途径均介导促凋亡过程，主要通过线粒体途径进行凋亡级联调控：影响Bcl-2家族蛋白在转录和/或转录后水平，继而级联激活Caspase家族引起细胞凋亡[26]。ERK1/2通路则可以通过转录和翻译后机制调控Bcl-2家族蛋白来实现抗凋亡，但也有报道其有促凋亡作用。

MAPK途径介导的细胞凋亡是一个治疗UC的潜在靶点，其中p38MAPK受到广泛研究。蒲公英甾醇是从蒲公英根提取的一种植物甾醇。车璐[27]通过实验证实其可通过抑制p38MAPK信号通路有效抑制结肠上皮细胞凋亡和减轻UC炎症反应，体现在蒲公英甾醇下调p38MAPK、Bax、Caspase-3，上调Bcl-2，并抑制NF-κB激活释放TNF-α、IL-6等致炎因子。白头翁皂苷B4是从白头翁中提取的一种生物活性三萜皂苷，被证明可通过抑制p53、Caspase-3和bax的表达对IEC具有抗凋亡作用[28]。

2.5 NF-κB介导途径NF-κB调节多种基因的转录和表达，在细胞增殖、分化、凋亡以及免疫、炎症调控等方面发挥重要作用。在静息状态下，NF-κB通常以p50和p65形成的异二聚体形式存在，并与抑制性蛋白IκBα结合成三聚体复合物被封存在细胞质中；在多种刺激因素如IL-1β、TNF-α、氧自由基及脂多糖等抗原的作用下，IκBα被IKK复合物催化发生磷酸化而解离，使得NF-κB异位至细胞核内激活转录。随后NF-κB转录表达各凋亡蛋白基因，调节由外在和内在途径介导的细胞凋亡[29]。此外，活化的NF-κB再度激活致炎因子TNF-α、ILs，并通过正反馈使NF-κB活化释放更多炎症介质，加重炎症反应和黏膜损伤。

IKK/IKB/NF-κB通路是NF-κB活化的经典信号通路。相关研究表明黄芩苷通过调节IKK/IKB/NF-κB对TNBS诱导的UC大鼠具有显著的抗凋亡作用，与下调Cyt-C、Caspase-3、Caspase-9和Bax等凋亡蛋白表达相关[30]。山药皮提取物6,7-二羟基-2,4-二甲氧基菲可通过抑制ERK1/2、NF-κB p65、pNF-κB、COX-2蛋白表达，显著下调Caspase-3和凋亡率，并可降低结肠致炎因子的产生，显著改善DSS诱导的结肠黏膜损伤[31]。黄连素是黄连的有效活性成分之一，研究证实其可通过抑制IEC凋亡和炎症反应来维持肠上皮屏障的完整性，表现在抑制IκBα的磷酸化及NF-κB p65的核异位，下调Bax、Caspase-3、TNF-α等致炎因子和上调Bcl-2，明显缓解肠上皮细胞的凋亡，改善黏膜屏障功能[32]。

2.6 PI3K-Akt信号途径 蛋白激酶B（Protein Kinase B,PKB/Akt）是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，由磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3-Kinases,PI3K）激活和调控，PI3K-Akt信号通路通过磷酸化调控叉头框O转录因子（FoxO），调节细胞增殖和存活[33]。FoxO已经成为PI3K/Akt调控细胞凋亡的一个重要效应臂，通过驱动多个凋亡基因表达的信号传导：（1）FoxO通过增强FasL和TRAIL等促凋亡因子的转录，直接调控外在凋亡通路；（2）FoxO可以上调Bad、Bim、BNIP3，抑制Bcl-xL，通过内在凋亡途径诱导细胞死亡。

黄芩苷抑菌抗炎活性显著，朱磊等[34]研究发现其可通过PI3K-Akt途径抑制结肠组织COX-2、Caspase-9、FasL等蛋白的表达，从而缓解上皮细胞凋亡。木香根被证实是天然抗炎剂，以其为原料的木香根颗粒可抑制UC大鼠的炎症反应和结肠上皮细胞凋亡，潜在机制分析表明可能与其调控PI3K/Akt信号通路相关[35]。因此，通过调控PI3K-Akt信号通路抑制FoxO的表达对防止IEC过度凋亡有着重要作用。

2.7 其他相关途径 除上述介绍的途径之外，还有一些其他报道的途径与抗IEC凋亡相关。如Janus激酶/信号转导和转录激活因子3（JAK/STAT3）信号通路，具有信号转导和调控转录的作用，同样调控着细胞凋亡。步楠等[36]研究发现雷公藤多苷可通过抑制JAK2/STAT3信号通路上调大鼠结肠组织Bcl-2、Bcl-xL、下调Caspase-9和Caspase-3以及炎症因子的表达，表现出显著的抗IEC凋亡作用。此外，藏红花素可通过上调Bcl-2/Bax，下调Caspase-3来缓解结肠细胞凋亡，其潜在作用机制与抑制TLR4/MYD88信号通路的激活相关[37]。

3 小结与展望

肠上皮细胞异常凋亡破坏黏膜屏障的完整性，削弱了肠道的防御功能，是UC发病发展过程中的关键环节。其中死亡受体（外在）和线粒体（内在）介导途径是关键，其他途径通过各种信号通路影响，介导外在和/或内在凋亡途径引起IEC凋亡。中药及提取物可通过多途径起到良好的抗IEC凋亡作用。在UC期间，抑制炎症介质释放和维持肠道黏膜屏障的完整性是现有药物的主要靶点之一。由于已知的不良反应和不断上升的药物治疗成本，植物性抗炎剂在肠道炎症性疾病中逐渐受到重视。安全有效的中药及其提取物的开发利用无疑是治疗UC的一种有吸引力的替代方法。未来研究可从以下几方面深入：（1）中药及提取物抗细胞凋亡作用机理尚不明确，缺乏大量的临床试验，药理学层面的研究尚需深入探讨；（2）有些途径如MAPK介导途径对细胞凋亡有双重调控作用-促进或抑制，这仍需大量试验研究明确个中机制；（3）某些药物如黄芩苷可通过多途径调节肠上皮细胞凋亡，其与UC核心靶点网络的潜在相互作用及串扰值得进一步探索。