灰鹤大肠杆菌的分离鉴定与致病性

陈文东，陈耀年，何玉鹏，叶文斌，苏满春，徐永平

(1.陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃 成县 742500；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730000；3.西北农林科技大学动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

灰鹤(Grusgrus)属鹤形目鹤科，又称千岁鹤、番薯鹤、玄鹤等，为栖息在近水区域和沼泽地的大型迁徙涉禽，其为杂食性动物，常选择草洲、稻田、浅水区和泥滩生境作为栖息地，以植物根茎、植物嫩芽、草籽、蒲公英、农作物种子等为食[1]。我国境内灰鹤的分布广泛，东起黑龙江抚远县，西至新疆喀什地区，南到四川若尔盖草原，北达内蒙古甘河流域，包括甘肃、吉林、内蒙古、青海、黑龙江、新疆和宁夏等，分布范围在东经76°～135°，北纬32°20′～53°[2]。研究表明，甘肃地区灰鹤多为旅鸟或夏候鸟，少部分为冬候鸟，境内陇南山地、兰州黄河、甘南高原、祁连山地、黄土高原和河西走廊的灰鹤为迁徙灰鹤[3]。

本试验从陇南受伤的灰鹤泄殖腔内分离出1株大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)，对其进行生化试验、16S rRNA基因测序和遗传进化树分析，并通过药敏试验和小鼠致病试验对其进行耐药性和致病性分析，为大肠杆菌引起灰鹤腹泻的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝培养基(EMB)、鲜血琼脂培养基、革兰染液，均购自青岛海博生物技术有限公司；BGI D2 000 Plus DNA Ladder、BGI 2×Super PCR Mix，均购自武汉华大基因科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖，购自厦门太阳马生物工程有限公司；磁珠法PCR清洁试剂盒，购自上海硕美生物科技有限公司；18种药敏纸片，购自湖南比克曼生物科技有限公司。PCR引物合成及测序由武汉华大基因科技有限公司完成。

1.2 主要仪器 PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品；高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品；超净工作台，浙江孚夏医疗科技有限公司产品；恒温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司产品；电热式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司产品。

1.3 样品采集及细菌分离纯化 用无菌棉签采集灰鹤泄殖腔内容物，置于装有无菌生理盐水的离心管内，充分混匀后，离心，将上清液接种于麦康凯琼脂平板上，37 ℃恒温培养18 h后，用接种环挑取红色菌落接种于另一麦康凯琼脂平板，继续37 ℃恒温培养18 h，如此反复纯化细菌5次，最后1次将菌株分别接种于鲜血琼脂培养基和伊红美蓝培养基，观察2种培养基上的菌落形态特征，再挑取单菌落进行革兰染色，显微镜下观察细菌的染色特点和形态特征。

1.4 生化鉴定 参照《兽医微生物学实验教程》[4]中生化试验培养基配制方法、操作步骤和结果判定方法，对分离菌进行生化鉴定，观察并记录结果。

1.5 16S rRNA基因PCR扩增及系统进化树分析 常规提取分离菌株的基因组DNA，制备DNA模板并进行16S rRNA的PCR扩增，PCR所用引物序列见表1。PCR反应体系(30 μL)：1 μL DNA模板，15 μL 2×GC Buffer Ⅰ，2 μL引物(上、下游各1 μL)，最后加ddH2O至30 μL。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min；96 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min，于4 ℃保存。参照磁珠法PCR清洁试剂盒说明书纯化PCR产物，纯化后进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带大小，回收PCR产物后寄至武汉华大基因科技有限公司进行测序，测序结果进行NCBI-BLAST比对并用邻接法(Neighbor-Joining algorithm,N-J)构建系统发育树。

表1 引物信息

1.6 药敏试验 用纸片扩散法(Kirby-Bauer，K-B)[5]对分离菌进行药物敏感性试验，参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准，调整菌液浓度至5×108CFU/mL，将菌液均匀涂布于普通琼脂平板，静置片刻后，用无菌镊子将18种常用抗菌药药敏纸片贴于平板表面，37 ℃恒温培养18 h，游标卡尺测量抑菌圈直径，结果按耐药(R)、敏感(S)和中介(I)判定。

1.7 致病性试验 将12只BALB/c小鼠(体重18～22 g，雌雄各半)随机分成试验组和对照组，每组6只。试验组腹腔注射细菌悬液(生理盐水将菌液调配至浓度为2.12×109CFU/mL)，每只0.5 mL，对照组腹腔注射等量生理盐水，观察小鼠死亡情况，剖检死亡小鼠，做剖检记录，并于病变明显部位取样分离病原菌。将剖检小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏固定于4%多聚甲醛内，制作病理组织切片，观察各器官的组织形态学变化。

2 结果

2.1 细菌分离纯化 分离菌株可在鲜血培养基上生长，无溶血环；在麦康凯琼脂培养基上生长为红色菌落，菌落呈圆形、半透明，表面湿润光滑，边缘整齐；在伊红美蓝培养基上形成紫黑色菌落，菌落有金属光泽，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐。革兰染色显示菌体呈长短不一的短杆状，两端钝圆，红色，散在分布。

2.2 生化鉴定 分离菌株可发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖，对甘露醇、MR试验和吲哚试验呈阳性反应，对硝酸盐、尿素酶、硫化氢、V-P试验、柠檬酸盐反应呈阴性反应。上述结果与《伯杰细菌鉴定手册》[6]比对，初步判定分离菌株为大肠杆菌，命名为HH1。

2.3 16S rRNA基因PCR扩增及系统进化树分析 将PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，样品均可得到明亮的大小为1 500 bp的电泳条带(图1)，与预期大小相符，符合测序条件。测序结果进行NCBI-BLAST比对，结果显示，HH1与大肠杆菌的同源性达99%。用MEGA 7.0软件构建系统进化树，结果显示，HH1与大肠杆菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)聚为一簇，亲缘关系最近(图2)。PCR扩增、系统进化树分析结果结合生化鉴定结果，判定HH1为大肠杆菌。

图1 分离菌16S rRNA的PCR扩增

图2 分离菌16S rRNA序列的系统进化树(N-J法)

2.4 药敏试验 HH1对青霉素、红霉素、多西环素和四环素耐药，对庆大霉素、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢呋辛、哌拉西林、氨苄西林、卡那霉素、链霉素、阿米卡星、米诺环素和多黏菌素敏感(表2)。

表2 药敏试验结果

2.5 致病性试验 试验组小鼠于腹腔接种细菌悬液8 h后开始出现死亡，至接种17 h后全部死亡，对照组小鼠未见异常。剖检死亡小鼠，可见小鼠胃呈明显臌气状，脾脏、肾脏出现轻微充血，肺脏有明显淤血斑块。从死亡小鼠的肺脏内分离病原菌，经鉴定为大肠杆菌，与攻毒菌株一致。病理组织切片观察可见，死亡小鼠肺脏肺泡内有明显的渗出，其余内脏组织未见明显病理变化。

死亡小鼠内脏病理切片结果显示，心脏未见明显异常，可见纵切心肌纤维及部分心肌纤维断面，心肌细胞和结缔组织细胞胞核清晰可见，心肌内毛细血管未见扩张；肝脏中央静脉和肝血窦内见少量红细胞，其他结构未见明显异常，肝细胞胞质呈粉红色，边界清晰，胞核呈圆形，蓝紫色，核仁清晰可见，肝细胞以中央静脉为中心呈索状排列，形成不规则的肝索；脾脏未见明显异常，组织切片观察可见明显的白髓和红髓区，白髓内可见中央动脉及动脉周围淋巴鞘，红髓内含较多红细胞，脾小梁清晰可见；肺脏切片可见呼吸性细支气管和大部分肺泡内有明显渗出，部分肺泡外周见少量炎性细胞，肺泡壁略增厚(图3)；肾小管部分管腔及管腔之间有红细胞聚集，肾小球未见明显异常。

图3 分离菌致死小鼠肺脏病理切片观察(200×)

3 讨论

灰鹤是国家二级保护野生动物，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ中[7]，据报道，截至21世纪初，我国分布的灰鹤总数为21 632～22 401只[3]。张成林等[8]对我国鹤类疾病发生情况进行统计分析，发现引起鹤类发病的主要原因为细菌感染、寄生虫感染和营养因素，细菌感染因素中大肠杆菌为引起鹤类发病的主要病原菌之一。张伟木等[9]证实，引起3例幼灰鹤死亡的致病性大肠杆菌血清型为O111B14。此外，在孔雀、蓑羽鹤和丹顶鹤等珍稀飞禽中均有因感染大肠杆菌而死亡的病例，因此，大肠杆菌正严重威胁着野生飞禽的生命健康[10-11]，给保护珍稀野生飞禽工作带来诸多挑战。

药敏试验结果显示，HH1对青霉素、红霉素、多西环素和四环素具有耐药性。Dou等[12]报道，国内东部地区的243株禽致病性大肠杆菌中，有98%的菌株对四环素耐药；胡紫萌等[13]分离鉴定的禽致病性大肠杆菌对四环素的耐药率更是高达100%；郭长明等[14]分离的大肠杆菌对多西环素的耐药率为100%；彭严严等[15]分离的9株鹅源大肠杆菌全部含β-内酰胺类耐药基因；陈文静等[16]研究表明，鸭源致病性大肠杆菌100%对红霉素耐药，上述研究结果与本试验分离大肠杆菌的耐药性结果一致，这可能是灰鹤在采食或迁徙的过程中与家禽接触产生的相互感染。野生飞禽几乎不使用抗菌药，但其所携带致病菌却表现多重耐药性(对3种或3种以上抗菌药耐药)，这可能会严重危害公共卫生安全，值得高度重视[17]。本试验为救治灰鹤的临床用药提供理论依据，并取得了较好的治疗效果。

本试验16S rRNA基因测序结果显示，分离菌株与大肠杆菌同源性最高，达99%。系统发育树分析结果显示，本试验分离菌株与大肠杆菌(MT424913.1.seq、MH111527.1.seq、MK729001.1.seq、OK325789.1.seq、MW175585.1.seq)为同一聚类，亲缘关系最近，而MH111527.1.seq和OK325789.1.seq均为来自于人类肠道内的大肠杆菌，表明该分离菌株有成为人兽共患病病原体的潜在性。

本试验小鼠致病性试验结果显示，分离菌株HH1主要引起小鼠肺泡腔内明显渗出，而对其他器官(心、肝、脾、肾)无明显致病作用。研究发现，禽类等多种动物的肺炎、败血症和肠炎等疾病多是因肠外致病性大肠杆菌引起的[18]，近年来大肠杆菌引起动物呼吸系统病变死亡的报道较多，有学者分别从水貂肺脏[19]、狐狸肺脏[20]及因患呼吸系统疾病而死亡的水貂肺脏[21]内分离出致病性大肠杆菌。由此可见，本试验分离到的大肠杆菌极有可能为禽肠外致病性大肠杆菌，且该菌具有一定的器官侵害倾向。