非培养表皮细胞对比毛囊滤泡细胞悬液移植治疗稳定型白癜风的Meta分析

孙晓明，陈菊萍，刘 军，齐丹丹，杨镜徽，马 江

（扬州大学附属医院皮肤科，江苏 扬州 225009）

白癜风是一种由于表皮基底层黑素细胞的丧失导致的一种获得性色素沉着障碍性疾病，对患者尤其是肤色较深的患者造成极大的心理负担和生活质量的影响。白癜风主要分为节段性和非节段性［1，2］。白癜风的治疗包括药物治疗，光疗和手术治疗等，在大多数个体中这些治疗只能使部分皮损复色［3，4］。手术治疗是药物治疗无效的稳定型白癜风的一种重要的替代治疗方式，通过将完整的黑素细胞从色素沉着部位转移到脱色部位，从而恢复皮损处色素沉着［5］。手术治疗包括组织移植方法和细胞移植方法，组织移植包括薄皮表皮移植、全厚度穿孔移植、吸疱移植和表皮收获系统，对于小面积药物治疗无效的稳定型白癜风皮损复色效果较好。细胞移植采用未培养的表皮悬液和培养的黑素细胞悬液细胞移植，细胞移植可以很容易地治疗大面积的脱色。

针对大面积的白癜风皮损，组织移植作为供体的代价将十分巨大，如何通过使用最少的供体，达到最优的复色效果，是大面积白癜风手术治疗的关键。细胞悬液移植治疗可以有效提高供体的作用面积，包括非培养表皮细胞悬液和培养的表皮细胞悬液治疗［6］。

目前关于白癜风手术治疗的系统评价尚无针对NCES（non-cultured epidermal cell suspension，NECS）和HFCS（hair follicular cell suspension，HFCS）两种方法具体的Meta分析［6，7］，本文针对NECS和HFSCS两者的复色效果进行Meta分析并对其不良反应及优劣进行讨论。

1 资料与方法

1.1 文献检索 本文在知网万方等中文文献库中未检索到关于NECS和HFCS单独比较的RCT（randomized controlled trial，RCT）研究， 故检索流程图仅限于英文文献，检索数据库为pubmed，Cochrane Library，Web of science，从Pubmed数据库MeSH中匹配“Vitiligo”及“Graft”的相关词汇，得到英文数据库的检索策略，为（（Transplants）OR（Transplant）OR（Grafts）OR（Graft）OR（Tissue Transplants）OR（Tissue Transplant）OR（Transplant，Tissue）OR（Transplants，Tissue）OR（Tissue Grafts）OR（Graft，Tissue）OR（Grafts，Tissue）OR（Tissue Graft）OR（Cell Transplants）OR（Cell Transplant）OR（Transplant，Cell）OR（Transplants，Cell）OR（Organ Transplants）OR（Organ Transplant）OR（Transplant，Organ）OR（Transplants，Organ）OR（Organ Grafts）OR（Graft，Organ）OR（Grafts，Organ）or（Organ Graft））AND （（vitiligo） OR （leukoderma）OR（Hypopigmentation）OR（Hypomelanosis）OR（Hypomelanoses））

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 ① 研究对象：确诊为稳定型白癜风且有符合面积皮损的白癜风患者。 ② 研究类型：RCTs研究，包括自身对照与对照组对照。③ 干预措施：NECS与HFCS相比。④ 结局指标：皮损恢复面积百分比。

1.2.2 排除标准 ① 非RCT研究。② 数据不全或缺失的文献。③ 动物研究或重复文献。

1.3 文献数据提取 根据纳入和排除标准严格筛选文献。首先通过阅读文献题目和摘要进行初筛，随后阅读初筛后的所有文献，筛选符合要求的文献纳入研究。本操作由两名独立的作者进行，两人完成后进行汇总分析，对有争议的文章，邀请第三人进行评判，共同商讨，完成文献的纳入。

1.4 文献质量评估 纳入研究的质量评估按照Cochrane 偏倚风险评估系统进行。 偏倚风险评估等级分为：高 /低风险偏倚和不明确三个等级。 偏倚评估类型有：选择、实施、测量、随访、报告、其他这几个方面的偏倚和分配隐藏。主要来源包括：如何制定产生随机序列的方式；实验和结局评估者和受试者是否采用盲法；研究结局数据是否完整等几部分。上述评估由两名作者独立完成后汇总。

1.5 统计学方法 应用软件Revman5.4做meta分析。对皮损恢复比率以及不良反应进行分析。采用比值比（OR）和 95%可信区间（CI）为分类变量的效应指标。检验异质性的指标用I2判断。当I2≤40%时，则应用固定效应模型分析数据；当I2＞40%时，根据研究之间是否具有统计学和临床异质性以及结果的差异有无统计学意义，判断是否进一步分析其异质性来源；决定是否采用随机效应模型进行分析。发表偏倚用漏斗图检验。

2 结果

2.1 文献检索结果 经检索得到53篇相关文献，阅读全文讨论后获得符合纳入标准的文献6篇。共纳入NECS组104处皮损，HFCS组99处皮损。文献筛选流程图见图1。

图1 文献筛选流程图

2.2 纳入研究的基本情况（见表1） NECS：非培养表皮细胞悬液移植；HFCS：毛囊滤泡细胞悬液移植。

表1 纳入文献基本信息

2.3 文献的质量评价 采用Revman5.4自带的Cochrane质量评价表对纳入的RCT文献进行评价，严格按照 Cochrane 评价条目进行。由两位作者独立完成汇总。评价结果见图2。

图2 偏倚风险评估表

2.4 疗效分析 六篇文献中的NECS与HFCS组中，年龄，性别，皮损面积等基线数据均无统计学意义（P＞0.05），各组数据之间具有可比性。

本文纳入的6篇文献中，评价指标为二分类变量，即术后皮损复色面积与术前皮损面积的百分比，规定复色百分比＞75%为显效11，对纳入文献的显效率进行汇总分析（见表2）。使用随机效应模型（异质性检验I2=31%）进行分析。总显效率合并RR=1.39，95%CL：（1.14，1.70），Z=3.22；P=0.001 ＜ 0.05，显示总显效率的P值有统计学差异。表明NECS组效果优于HFCS组。

表2 复色程度（±s）

表2 复色程度（±s）

作者 NECS组 HFCS组D.R.Gunaabalaji ［8］ 61.58±42.68 14＞75% Re 78.68±30，.03 P=0.1618 10＞75% Re C.Singh［9］＜50%：1 50%-74%：1 75%-89%：2 90%-100%：20＜50%：2 50%-74%：3 75%-89%：3 90%-100%：15 B.M.El-Zawahry ［10］＜50%：3 50%-74%：5 75%-100%：2＜50%：3 50%-74%：1 75%-100%：2 R.Pangti ［11］ 75%-100%：9 75%-100%：8 N.Donaparthi ［12］ 26%-50%：3 75%-100%：27 0%-25%：9 26%-50%：7 51%-75%：1 76%-100%：13 A.M.Hamza ［13］0%-49%：4 50%-74%：4 75%-89%：1 90%-100%：1 0%-49%：2 50%-74%：5 75%-89%：2 90%-100%：1

2.5 不良反应及患者选择 纳入文献中未统计不良反应为极个别情况，故未记录不良反应事件的发生率。在纳入文献中报道的不良反应中，疼痛，瘢痕为两者共同出现过的不良事件。其中NECS单独报道的不良事件有移植部位周围晕，两者均为少数事件，发生频率无统计学差异。

其它非RCT研究中报道出现的不良反应为NECS：受体部位：颜色不匹配、色素沉着、边缘晕、感染、斑驳色素沉着、灼痛不适。供体部位：Koebner现象、感染、增生性疤痕、色素沉着；NCFS：受体部位：颜色不匹配、色素沉着、感染、瘙痒、干燥。供体部位：色素沉着、增生性疤痕、感染。

2.6 敏感性分析及发表偏倚 根据总显效率的异质性做了敏感性分析，发现剔除“Navya Donaparthi 2016”这篇文献后，总显效率的异质性I2=0%，重复阅读文献后认为异质性的来源在于该实验样本量较大，以及作者所诉毛囊黑素细胞提取的数量有限。应用漏斗图进行评价，其中Ashraf 2019和 Bakr Mohamed 2017两篇，由于样本量较小，导致偏倚。剔除以上三篇文献后进行分析P=0.04＜0.05，显示总显效率的P值依旧有统计学差异，但由于剔除后样本量的大大减少，出于科学研究的严谨性，还需要更进一步RCT实验研究。

图3 总有效率漏斗图分析

3 讨论

非培养表皮细胞悬液包括非培养表皮细胞悬液移植和毛囊滤泡细胞悬液移植。非培养表皮细胞悬液移植引入于1992年［14］，主要采用从供区（一般为大腿内侧或臀部）取薄层皮肤移植物，使用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液培养皿，经过孵育，分离，离心获得含有黑素细胞的细胞悬液均匀涂抹于使用CO2激光或人工擦皮至点状出血的白癜风皮损表面固定［15］。在非培养的表皮细胞悬液中，角质形成细胞与黑素细胞没有分离，角质形成细胞有助于提供维持和促进黑素细胞生长和色素同质性的因子。

毛囊滤泡细胞悬液又名滤泡外根鞘悬液（NCEHF-ORS-CS），移植于2009年［16］进行供体部位的改进，相较于非培养表皮细胞悬液移植，不同之处在于供区为毛囊，是黑素细胞及其前体细胞的重要储存库。将供区毛发修剪到约2毫米，局部浸润麻醉。一般选择枕部头皮约50个毛囊，使用一次性1毫米皮肤活检穿刺器获取卵泡单位，冲头沿着毛囊的方向旋转，直到到达真皮中部。然后，用细镊子握住毛干周围的皮肤，轻轻将毛囊拔出。然后，使用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液培养皿37℃培养后，用PBS溶液中和，然后离心获得含有黑素细胞的细胞悬液均匀涂抹于使用CO2激光或人工擦皮至点状出血的白癜风皮损表面固定［17］。

图4 偏倚风险评估表

图5 NECS与HFCS的有效率比较

图6 剔除后NECS与HFCS的有效率比较

毛囊和表皮作为皮肤组织中产生色素的细胞来源，理论上讲，在细胞群体组成、黑素细胞表型和功能以及细胞微环境等方面，毛囊被认为是治疗白癜风更有利的细胞来源。

首先，毛囊的外层被称为外根鞘（ORS），在中下部包含一个由分化差的无色素性或浅色的黑素细胞组成的黑素细胞库，其中的二氢氧苯丙氨酸（dihydrooxyphenylalanine，DOPA），是黑素发生的中间产物。黑素细胞干细胞（melanocyte stem cells，MeSCs）是毛囊内的主要黑色素细胞类型，是一种不同于活性黑色素细胞的DOPA阴性的头发黑素细胞群体。体外研究表明，MeSCs具有很高的增殖潜能，可在白癜风病灶的再变色过程中作为黑素细胞库，其原位时并不活跃，在迁移到表皮上层时，通过逐渐转变为DOPA阳性的黑色素细胞，积极产生黑色素并使白癜风皮肤变色。据推测，白癜风患者毛囊中的黑素细胞干细胞由于其表面缺乏黑素细胞抗原而躲过了T细胞介导的凋亡而未受损伤。此外，表皮和头发黑色素细胞表达不同的抗原谱，因此它们在白癜风和斑秃中优先被不同的循环抗体靶向。提示与表皮黑素细胞相反，毛发黑素细胞不表达白癜风相关抗原。这种差异可能在理论上使毛囊比皮肤表皮更能补充失去的黑素细胞，因为毛囊衍生的黑素细胞可能不太容易受到受体生态位中病理微环境的影响。其次，与表皮黑色素单位（每36个角质细胞对应1个黑素细胞）相比，毛囊黑色素单位（平均每5个毛球角质细胞对应1个黑素细胞）中的黑色素细胞密度更高，这似乎是毛囊治疗白癜风的另一个优势。不仅如此，毛囊衍生的黑色素细胞更大，更树突。它们具有更广泛的高尔基体和粗面内质网以及更大的黑素体，因此具有更高的合成能力。最后，除了毛囊与表皮细胞悬液共有的黑素细胞、角质形成细胞和角质形成干细胞外，毛囊来源的细胞悬液还含有可能影响色素再生过程的细胞和分子成分。毛乳头被毛囊（底部毛囊的膨大部分）包围，是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和毛发生长和黑色素形成所必需的生长因子的来源。此外，由于在采集毛囊时可能会提取周围的一小部分真皮，真皮驻留的间充质干细胞也可能存在于毛囊来源的细胞悬液中。结果表明，真皮间充质干细胞可能通过抑制周围CD8 T细胞对白癜风病变重新着色的负面作用而增强细胞移植的疗效［18］。

然而经过系统的RCT实验研究，毛囊细胞悬液的复色并未如理论般优于表皮细胞悬液。可能存在的原因包括：毛囊色素沉着依赖于黑素细胞、无黑色素细胞和它们在毛囊膨大中的前体之间复杂的相互作用，与只有分化的黑素细胞的表皮相比，这是很难恢复的。且毛囊中的黑素细胞干细胞受角化细胞、真皮乳头细胞以及毛囊外信号的调控，其多尺度的调控机制比表皮重生化复杂得多。细胞悬浮液无法补充毛囊膨出区域的黑素细胞干细胞及其他复色需要的相关生长因子如角质形成细胞来源的生长因子的丢失及缺乏，因而导致了低于预期的复色效果。

两者方法的主要差别在于供体的选择，NECS选取着色正常的皮肤，操作方法相对于HFCS更为简单，主要存在的问题为术后边缘晕及供体部位Koebner现象，NECS发展较为成熟，相对于培养的表皮细胞悬液，非培养表皮细胞悬液的经济成本相对更低，操作也更为简便。虽然非培养表皮细胞悬液供受体比例可达1∶10，低于培养的表皮细胞悬液的1∶60［19］，但黑素细胞培养费时昂贵且需要专门的细胞培养实验室和高度刺激的培养基碱性成纤维细胞生长因子。对于不熟练提取毛囊细胞的术者，可能是一种更为稳妥的选择。

HFCS选取毛囊卵泡单位，只由几个穿孔获得，从而能够快速愈合，但HFCS方法需要准确识别毛发生长初期的毛囊，在采集前需要剃掉或修剪头皮毛发，且存在毛囊横切从而大大减少悬液中的复色相关细胞的风险，固而HFCS对操作者要求较高。本文收集的RCT文献中，就有一篇文章因为毛囊提取单位的质量及数量问题，导致复色程度的大幅下降。并且，HFCS复色速度较NECS更加缓慢。在针对患者的调查问卷中，除Ashraf2019外，患者都更倾向于选择NECS，其原因可能并不仅仅如Ashraf2019中所说，是因为NECS复色速度较HFCS更快导致。且HFCS为近期提出的更为新颖的技术，不排除发表偏倚的存在，但恰恰是因为HFCS是新技术，在毛囊提取和创造补充复色需要的生长因子以及如何保留干细胞的活性，都是需要进一步探索的方面。通过HFCS操作的进一步提高和毛囊研究的进一步升化，HFCS可以拥有更为广阔的前景。也有研究显示NCES和NCFS联合使用相对于单独使用NCES或HFCS，可提高重着色率。其优越性在于表皮细胞悬液中含有干细胞因子和碱性成纤维细胞生长因子，这可能刺激了滤泡细胞悬液中存在的干细胞的增殖或许这会成为细胞悬液移植更为有效的途径［20，21］。在Meta分析中，当包括Navya2016文献时I2=31，P＜0.05，虽然Navya2016是异质性的主要来源，但从异质性来源的原因也可以说明HFCS 操作的困难程度更高即对术者的要求更高。当排除Navya2016文献及两个小样本实验Ashraf 2019和 Bakr Mohamed 2017后，森林图中的显效率倾向于NECS，P =0.04＜0.05有统计学意义。但由于剔除后样本量大大减少，出于对实验的严谨性，针对NECS和HFCS的优劣性问题，还需要更多临床RCT的检验。

关于NECS和HFCS的优劣，无论是患者满意度还是复色程度，目前更倾向于NECS。但出于科研的严谨性还需要更多RCT的比较，不论是NECS还是HFCS，对于大面积的药物难治性稳定性白癜风都有着更好的疗效和更优的性价比，相对于其他手术方案，对供体的需求也更小，是白癜风手术治疗的一大重要方法，值得推广。HFCS作为一种更为新颖的非培养细胞移植方案，还需要更加深入的研究，关于毛囊提取的方法，细胞提取的方法，如何才能发挥毛囊滤泡单位更大的作用都是HFCS可以继续优化的方向。