LDLR基因突变致纯合子家族性高胆固醇血症外周血单核细胞LDLR表达的研究

张 晰， 段明玥， 于 壮， 魏孟姣， 张艳敏

（1.西安交通大学附属儿童医院 西安市儿童医院，陕西 西安 710003；2.西北妇女儿童医院，陕西 西安 610113）

家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）是一种常染色体单基因显性遗传代谢性疾病，编码低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）的LDLR基因是最常见的致病基因，LDLR基因突变可致细胞膜表面的LDLR缺失或功能异常，影响机体低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）的代谢，导致胆固醇代谢障碍，最终使血清低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和总胆固醇（total cholesterol，TC）水平升高[1-2]。根据基因型，FH可分为杂合型家族性高胆固醇血症（heterozygous familial hypercholesterolemia，HeFH）和纯合型家族性高胆固醇血症（homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH）。HeFH携带1个致病等位基因，HoFH携带2个致病等位基因。HoFH较为罕见，患病率为1/100万～3/100万，HeFH患病率为0.20%～0.48%[1]。我国人群FH患病率为0.18%[2]。HoFH患儿的LDL-C水平是正常儿童的6～10倍，皮肤肌腱黄色瘤及早发冠心病（coronary heart disease，CHD）风险增加等是HoFH典型的临床特征；如未经治疗，HoFH患儿青少年期即可发生CHD，在30岁之前就可能因心肌梗死而死亡，甚至有发生猝死的风险[3]。本研究拟分析1个FH家系LDLR基因突变及外周血单核细胞表面LDLR的表达情况。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年10月西安交通大学附属儿童医院确诊的1例LDLRE140K突变致HoFH先证者及其家系成员共5例。HoFH诊断标准参照欧洲动脉粥样硬化协会（European Atherosclerosis Society，EAS）2014年发布的HoFH管理指南[4]。临床诊断标准：治疗前LDL-C＞13 mmol/L或治疗后LDL-C＞8 mmol/L，且10岁之前出现皮肤或肌腱黄色瘤或父母LDL-C水平与杂合型FH一致。先证者基因诊断结果为LDLR基因纯合突变c.418G＞A（p.E140K）[5]。基因诊断标准：LDLR、APOB、PCSK9和LDLRAP1基因检测到明确的2个突变位点。本研究经西安交通大学附属儿童医院医学伦理委员会批准，所有对象或其家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集先证者及其家系成员临床资料，包括病史和体格检查、生化检测（血脂、心肌酶、肝肾功等测定）、心电检查结果和超声心动检查结果等。

1.2.2 外周血单核细胞表面LDLR表达的检测 采集所有对象外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝。取1 mL置于流式上样管中，加入红细胞裂解液（自配），溶血15 min，然后670×g离心5 min，弃上清，向底部的白细胞层加入磷酸盐缓冲液（ phosphate-buffered saline，PBS），充分混匀，制备成白细胞悬液。在白细胞悬液中加入CD45-PerCP抗体、CD14-FITC抗体（美国Novus Biologicals公司）和LDLR-APC抗体（美国BD公司），标记有核细胞，涡旋混匀，室温避光孵育15 min ，加入1 mL PBS洗涤细胞，670 ×g离心5 min，弃上清，最后加入500 μL PBS，涡旋混匀，采用FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）检测。使用Cellquest软件（美国BD公司）进行分析，以设逻辑门的方法在CD45/SSC散点图中根据CD14表达强弱的不同，设门圈出单核细胞，每个样本设同型对照，并采集10 000个细胞进行数据分析[6]，用平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）单核细胞LDLR表达水平表示。

1.3 统计学方法

采用SigmaStat 3.5软件进行统计分析。不同家系成员之间各项目的比较采用t检验。采用Pearson相关分析评估LDLR与血脂项目之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 先证者及其家系成员的临床表型分析

先证者（HoFH患儿）TC和LDL-C水平较高，临床表型重，确诊时已经出现心血管损伤，颈部超声提示双侧颈动脉及升主动脉内膜增厚并粥样硬化，心脏彩超提示主动脉瓣增厚、钙化，并出现主动脉关闭不全表现，膝关节可见黄色瘤。先证者父母均为HeFH患者（携带杂合突变），TC和LDL-C水平均高于与未携带突变（野生型）的家系成员（先证者大姨）（P＜0.05）。先证者父亲出现角膜环，双侧颈动脉硬化，有斑块形成；先证者母亲尚未发现动脉粥样硬化及冠心病表型。见表1。

表1 先证者及其家系成员基因型和血脂水平、临床表型信息

2.2 先证者及其家系成员单核细胞表面LDLR表达

先证者（LDLRE140K纯合型）、先证者父母（LDLRE140K杂合型）及先证者大姨（野生型）单核细胞表面LDLR的MFI分别为68.75、126.82、147.6、437.56。见图1、图2、图3。

图1 先证者及其家系成员单核细胞表面LDLR表达散点图

图2 先证者及其家系成员单核细胞表面LDLR表达峰图

图3 先证者及其家系成员单核细胞表面LDLR表达

2.3 先证者及其家系成员单核细胞表面LDLR表达与TC、LDL-C的相关性

Pearson相关分析结果显示，在LDLRE140K基因突变家系成员中，外周血单核细胞表面LDLR水平与TC、LDL-C均呈负相关（r值分别为-0.682、-0.664，P＜0.05）。

3 讨论

FH是一种常染色体显性遗传性疾病，主要临床表现为LDL-C水平明显增高、皮肤黄色瘤及早发CHD，可分为HoFH和HeFH 2种类型。目前，由于临床对FH认识不足，其诊断率较低，尤其是儿童HF的管理仍处于探索阶段[1]。日本动脉粥样硬化学会联合工作组发布的儿童FH指南[7]指出，早期诊断和早期干预可更好地改善FH患儿的预后。

本研究检测了1例LDLRE140K纯合突变的HoFH患儿及其家系成员的外周血单核细胞表面LDLR表达水平，结果显示，单核细胞表面LDLR的MFI呈LDLRE140K纯合型＜LDLRE140K杂合型＜野生型的趋势，提示HoFH患儿LDLR表达量显著降低，LDLRE140K变异对其携带者单核细胞表面LDLR的表达有显著的抑制作用，且纯合型的抑制作用强于杂合型。FH的致病基因主要包括LDLR、APOB和PCSK9，致病基因通过影响LDLR的表达、结构或功能造成机体胆固醇代谢障碍，最终导致FH[8-9]。LDLR是一类由高尔基体加工后转运到细胞表面的跨膜糖蛋白，功能是介导LDL的摄取，参与LDL代谢过程，并通过LDL循环调控机制保证机体胆固醇水平的动态平衡[10-11]。在所有FH的致病基因中，LDLR基因的突变频率最高，占总突变频率的90%以上[12-13]。在高胆固醇血症患者中可检出不同的LDLR基因变异[14-16]，但LDLR基因变异对携带者细胞表面LDLR表达的影响的相关研究较少。RODRÍGUEZ-JIMÉNEZ等[17]的研究结果显示，LDLR基因变异可导致LDLR表达和活性降低。LDLR基因对LDLR的影响主要体现在表达量和内化活性功能2个方面[18-19]。本研究结果显示，LDLRE140K突变可影响LDLR的表达量，即通过下调细胞表面LDLR的表达引发FH。后续将研究LDLRE140K突变对LDLR功能的影响。

本研究结果显示，先证者（LDLRE140K纯合突变）、先证者父母（LDLRE140K杂合突变）、先证者大姨（野生型）外周血单核细胞LDLR表达量依次升高，血清LDL-C及TC水平依次降低；先证者的临床症状最重，先证者父亲的临床症状相对较轻。提示LDLRE140K突变明显下调了单核细胞表面LDLR的表达，且下调程度与基因型有关。有研究结果显示，LDLR缺乏引起的动脉粥样硬化脂蛋白谱可被视为动脉粥样硬化的危险因素，HoFH患者淋巴细胞表面LDLR表达量与血清LDL-C、载脂蛋白B水平呈显著负相关（r值分别为-0.700、-0.667，P＜0.01），LDLR的残留表达是LDL-C水平的主要决定因素[19-20]。在难以治疗的FH患者中，通过中和抗体等方式增强LDLR表达可显著降低血脂水平，有助于改善FH患者的心血管状况。因此，检测外周血单核细胞表面LDLR水平可为FH患者的血脂评价与管理提供重要参考。

综上所述，LDLRE140K突变可下调FH患者LDLR的表达，且下调程度与基因型有关。检测LDLR基因突变及外周血单核细胞LDLR的表达有助于FH的早诊早治，减少FH患者心血管并发症的发生。