革兰染色与MALDI-TOF MS在快速鉴定儿童阳性血培养病原菌种类中的应用

杨 溪， 宋文琪， 董 方， 孟庆盈， 甄景慧， 周 为

（国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院检验科，北京 100045）

血流感染是一种严重的全身感染性疾病，病死率高、预后差。全球每年约有300万的新生儿患有败血症，死亡率为11%～19%[1]。2016年，我国因败血症死亡的≤5岁儿童占总死亡例数的2.5%[2]。及时、准确地诊断儿童血流感染非常重要。目前，临床诊断儿童血流感染的重要实验室依据仍为血培养结果，该方法需将报阳后的血培养转种至固体培养基，培养24～48 h，甚至更长时间后，分离出单个菌落，再进行细菌鉴定，结果报告周期长。而将阳性血培养物直接进行革兰染色镜检可了解病原菌的初步判断结果，但是不能鉴定出具体菌种。有研究发现，将无菌体液样本中的病原菌进行富集处理后，再使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）进行快速鉴定，可以大大缩短细菌鉴定时长。本研究以转种培养后的鉴定结果为标准，对革兰染色镜检和MALDI-TOF MS直接快速鉴定结果进行比较，为临床提供快速、准确的儿童血流感染实验室诊断依据。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集2019年2月—2020年10月首都医科大学附属北京儿童医院临床送检的阳性儿童需氧血培养瓶。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 8739）和大肠埃希菌（ATCC 25922）、粪肠球菌（ATCC 19433）、光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）购自法国生物梅里埃公司。

1.2 仪器和试剂

美国BD公司儿童需氧血培养瓶（BD BACTEC Peds Plus/F Culture Vials）和BACTEC FX全自动血培养系统，郑州安图公司哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板（不加抗菌药物），法国生物梅里埃公司MALDI-TOF MS仪、MS-DS靶板、α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）基质、甲酸和革兰染色液，德国布鲁克公司Sepsityper Kit，日本奥林巴斯公司BX53（LED）生物显微镜。

1.3 方法

1.3.1 转种培养 用1 mL一次性无菌注射器从阳性儿童需氧血培养瓶中抽取0.5 mL液体，同时接种于哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板（不加抗菌药物），分区划线，置于35 ℃ 5%～10% CO2孵箱中孵育18～24 h。再用MALDI-TOF MS仪对培养出的单个菌落进行鉴定，严格按照仪器说明书操作。

1.3.2 革兰染色镜检 用1 mL一次性无菌注射器从阳性儿童需氧血培养瓶中抽取0.5 mL液体进行革兰染色涂片镜检。

1.3.3 MALDI-TOF MS快速鉴定 从阳性儿童需氧血培养瓶中抽取1 mL液体，采用Sepsityper Kit进行前处理。具体操作方法为：将1 mL阳性儿童需氧血培养瓶中的液体注入eppendorf管中，加200 μL Lysis Buffer，漩涡震荡15 s，混匀后16 200×g离心2 min，弃上清，在沉淀中加入1 mL Washing Buffer，漩涡震荡30～60 s至沉淀完全溶解，16 200×g离心1 min，弃上清，取沉淀。将沉淀物点入MS-DS靶板，加1 μL MSCHCA基质（若为真菌，则先加0.5 μL甲酸，再加1 μL MS-CHCA基质），自然干燥后上机鉴定。严格按仪器说明书要求进行操作。结果判断：MALDI-TOF MS鉴定结果分为3种颜色，绿色表示唯一的鉴定结果，可信概率为60.0%～99.9%；黄色表示低分辨率结果，可信概率＞60.0%，需要进一步通过补充试验确认；红色表示不能鉴定，可信概率＜60.0%，与数据库的任何质谱数据均不匹配。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料用例或率表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转种培养结果

共收集166例阳性儿童血培养样本，其中单一菌样本162例（97.6%），2种菌样本4例（2.4%）。162例单一菌样本中，检出革兰阳性菌95株（58.6%），以凝固酶阴性葡萄球菌最多（61.1%）；革兰阴性菌63株（38.9%），以肠杆菌科细菌最多（76.2%）；酵母样真菌4株（2.5%），包括3株白念珠菌和1株近平滑念珠菌；见表1。4例2种菌样本转种培养后的鉴定结果见表2。

表1 162例单一菌样本3种方法鉴定结果比较

表2 4例2种菌样本3种方法鉴定结果

2.2 革兰染色镜检结果

与转种培养结果比较，162例单一菌样本中，革兰染色镜检结果符合率为97.5%（158/162），其中革兰阳性菌符合率为97.9%（93/95），革兰阴性菌符合率为96.8%（61/63），酵母样真菌鉴定符合率为100.0%（4/4）；4例2种菌样本革兰染色镜检结果与转种培养后结果一致。见表1、表2。

2.3 MALDI-TOF MS快速鉴定结果

与转种培养结果比较，162例单一菌样本中，MALDI-TOF MS快速鉴定结果符合率为85.2%（138/162），其中革兰阳性菌鉴定符合率为81.1%（77/95），革兰阴性菌鉴定符合率为92.1%（58/63），酵母样真菌鉴定符合率为75.0%（3/4）；4例2种菌样本MALDI-TOF MS快速鉴定只能鉴定出其中1种菌。MALDITOF MS快速鉴定法对革兰阴性菌的鉴定符合率明显高于革兰阳性菌，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、表2。

2.4 不同报阳时长（time to positivity，PPT）MALDI-TOF MS鉴定结果比较

162例单一菌样本平均TTP为21 h，其中革兰阳性菌样本平均TTP为23 h，革兰阴性菌样本平均TTP为18 h，酵母样真菌样本平均TTP为28 h。TTP≥21 h与TTP＜21 h比较，MALDI-TOF MS鉴定结果符合率差异有统计学意义（P＜0.05）。不同TTP条件下，MALDI-TOF MS鉴定革兰阴性菌的符合率差异具有统计学意义（P＜0.05），鉴定革兰阳性菌的差异无统计学意义（P＞0.05）。不同PPT质谱鉴定结果见表3、表4。

表3 不同TTP MALDI-TOF MS鉴定结果比较 例

表4 不同TTP革兰阴性菌样本MALDI-TOF MS鉴定结果比较 例

3 讨论

在临床微生物实验室常规工作中，当出现血培养阳性时，需将阳性血培养样本从血培养仪中取出进行革兰染色镜检，并在2 h内将革兰染色结果报告给临床，同时将报阳样本转种至固体培养基，待培养18～24 h或长出单个菌落时，再进行菌种鉴定和体外药物敏感性试验，该过程一般耗时1～2 d。革兰染色镜检可在短时间内获知有无细菌，以及细菌大致的类型（革兰阳性球菌、革兰阴性菌或真菌），但是革兰染色镜检影响因素较多，易导致结果的误判误报[3-4]。而MALDI-TOF MS可以直接将阳性血培养样本中的病原菌鉴定到种，样本前处理方法包括去污剂选择裂解法、渗透压选择裂解法、分离胶分离法、滤膜过滤分离法，操作简单、方便快捷，均可在1 h内获得细菌鉴定结果[5-6]。

本研究收集的162例单一菌儿童需氧血培养阳性样本中最常见的病原菌为革兰阳性菌，占58.6%，革兰阴性菌占38.9%，酵母样真菌占2.5%，与多数儿科医院血流感染病原菌分布[7-11]结果相似，均是以革兰阳性菌为主，最常见的是凝固酶阴性葡萄球菌（48.21%～55.7%）。但相关文献显示，2018—2019年全国血流感染病原菌以革兰阴性菌（72.1%）为主，最常见的为大肠埃希菌（37.2%）和肺炎克雷伯菌（17.0%），可能与就诊患者年龄差异有关[7-11]，提示儿童血流感染病原菌与成人有所不同。

本研究以转种培养后的鉴定结果为标准，革兰染色镜检结果符合率为97.5%（158/162），有4例样本与转种培养后结果不一致，1株屎肠球菌与1株唾液链球菌被误报为革兰阴性杆菌，2株鲍曼不动杆菌被误报为革兰阳性菌，考虑可能与细菌形态不典型、染色偏差和镜检者缺乏临床经验有关[3-4]；MALDI-TOF MS鉴定结果符合率（85.2%）低于革兰阴性菌（92.1%），但差异无统计学意义（P＞0.05），与相关文献结果[5，12-14]基本一致。本研究结果显示，MALDITOF MS快速鉴定除凝固酶阴性葡萄球菌外的革兰阳性菌的符合率可达89.2%（33/37）。MALDI-TOF MS快速鉴定革兰阳性菌的符合率较低，可能与样本前处理方法不当或与数据库局限性有关。CORDOVANA等[14]发现，可以通过改良Sepsityper Kit中样本前处理的步骤来提高MALDI-TOF MS对革兰阳性菌的鉴定符合率，如将Lysis Buffer的用量减半，或在使用Lysis Buffer和Washing Buffer的间隙增加一步水洗的过程，从而提高革兰阳性菌的鉴定符合率。也有研究发现，可以通过提取法和优化数据库等方法提高MALDI-TOF MS对革兰阳性菌的鉴定符合率[15-17]。本研究结果显示，当TTP＜21 h时，MALDI-TOF MS与传统血培养鉴定符合率较高（P＜0.05），与相关研究结果[13，18]一致；当TTP＜21 h时，MALDI-TOF MS鉴定革兰阴性菌的符合率更高；但不同TTP条件下，MALDITOF MS快速鉴定革兰阳性菌与传统血培养符合率差异无统计学意义（P＞0.05）。

TORRES等[19]发现，阳性血培养的革兰染色结果可以作为临床早期调整经验性抗感染治疗的依据，但是通过MALDI-TOF MS快速鉴定可以明显提高最终接受正确抗菌药物治疗的患者比例（P=0.008）。NIWA等[20]的研究结果显示，与传统的转种培养相比，通过MALDITOF MS快速鉴定血培养样本中的病原菌，并将结果及时通知临床，可以更早地指导临床调整用药方案，如将广谱抗菌药物改为有针对性的窄谱抗菌药物、停止不恰当或过度的抗菌药物治疗，从而将患者得到有效和最优化的抗感染治疗方案的时间分别缩短13.3和38.4 h；肝毒性、肾毒性和血小板减少等不良事件的发生率（分别为3.8%、1.1%和0%）与传统转种培养法（分别为12.2%、5.0%和4.4%）相比明显降低（P＜0.05）；同时，临床治疗失败率也由33.3%降至14.0%（P＜0.05）。对于儿科患者来说，阳性血培养样本中革兰阴性杆菌的TTP是患儿住院死亡率、败血症休克的独立危险因素，对于儿科患者来说，阳性血培养样本中革兰阴性杆菌的TTP是其患败血症休克的独立危险因素，TTP越短，患儿的住院死亡率越高，住院费用也会相应增加[21-22]。所以，快速鉴定儿童阳性血培养病原菌有重要的临床意义。

革兰染色镜检可以在短时间内告知临床病原菌的类别，但不能具体到种属；而采用MALDI-TOF MS可以直接将阳性血培养样本中的病原菌鉴定到种。本研究采用Sepsityper Kit进行样本前处理仅需要几分钟，操作简便、易于标准化。检验人员在报告革兰染色镜检结果的同时，通过MALDI-TOF MS可直接报告细菌鉴定的结果。本研究中，有4株菌革兰染色镜检结果与转种培养后的结果不一致，但是经过MALDI-TOF MS快速鉴定，此4株菌均被正确鉴定到种。对于MALDI-TOF MS未能鉴定出结果的样本，革兰染色镜检结果均与转种培养结果相符。但是，虽然MALDI-TOF MS能快速地将阳性血培养中的病原菌鉴定到种，但也存在局限性，如对于沙门菌只能鉴定到属，无法区分志贺菌与大肠埃希菌，真菌鉴定率低，对于2种菌样本大多数只能鉴定出其中1种菌。本研究只收集到4例含酵母样真菌的阳性血培养样本，MALDI-TOF MS鉴定符合率为75.0%（3/4）。而有研究共收集到194例含酵母样真菌的阳性血培养样本，鉴定符合率仅为37.1%（72/194），但是通过优化样本前处理，可将其鉴定符合率提高至89.5%（68/76）[14]。许春燕等[5]的研究结果显示，MALDI-TOF MS真菌的种鉴定率也仅为32.4%（12/37）。本研究共收集到4例含有2种菌的阳性血培养样本，MALDI-TOF MS均只能鉴定出其中1种菌。但有研究发现，含2种菌的阳性血培养样本中有12.5%～32.8%的样本使用MALDI-TOF MS快速鉴定法能同时鉴定出其中所有的病原菌[12，14]。有学者通过将含2种菌的阳性血培养样本进行短时培养，再用MALDITOF MS进行快速鉴定，可将鉴定符合率提高至86.0%（43/50）[23]。

综上所述，革兰染色可以在短时间内对儿童阳性血培养中病原菌的类别做出初步判断，而MALDI-TOF MS快速鉴定可以将其鉴定到种。革兰染色与MALDI-TOF MS均可在短时间内对儿童阳性血培养中的病原菌做出快速判断，从而为临床及时诊治儿童血流感染提供实验室依据，降低血流感染患儿病死率。