MUC16对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

李名武， 王勤志， 孙法瑞

（鄂东医疗集团市 黄石市中心医院 湖北理工学院附属医院骨科，湖北 黄石 435000）

骨肉瘤好发于儿童和青少年人群，随着治疗方法的不断改进，患者生存率有所提高[1]，但由于骨肉瘤的侵袭性强、复发率高、易早期发生远隔转移，使得患者总体预后仍然较差[2]。黏蛋白16（mucin 16，MUC16）是黏蛋白家族成员，在上皮保护和修复中发挥着重要作用，与信号通路传导调控及免疫应答关系密切[3]。有研究发现，MUC16参与了卵巢癌[4]、胆囊癌[5]、子宫内膜癌[6]、肺癌[7]等多种恶性肿瘤的发生、发展过程。然而，关于MUC16与骨肉瘤关系的研究较少。为此，本研究拟探讨MUC16对人骨肉瘤细胞系U2OS增殖和侵袭能力的影响。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

人骨肉瘤细胞系U2OS购自上海通派生物科技有限公司，McCoy's 5A培养液购自上海研生生物技术科技有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自美国Gibco公司。MUC16干扰序列和对照序列由上海美轩生物科技有限公司设计合成。Lipofectamine 2000脂质体转染试剂和Trizol提取试剂均购自美国Invitrogen公司，逆转录和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂购自宝生物工程（大连）有限公司，MUC16和内参引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自上海科华生物工程股份有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自北京博润莱特科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，基质胶购自美国BD公司。兔抗人MUC16单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人上皮型钙黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）多克隆抗体、兔抗人神经型钙黏蛋白（neuropathic-cadherin，N-Cad）单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。StepOne实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，DP-6100型酶标仪购自北京亚欧德鹏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培养液于37 ℃、5% CO2条件下培养U2OS细胞。培养24 h后，用胰蛋白酶消化，传代培养。取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化，接种于6孔板，密度为2.5×106/孔，待细胞融合度为80%以上时，按Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书对细胞进行分组转染。（1）sh-MUC16组：转染MUC16干扰序列sh-1（5'-ACAGCAGCATCAAGAGTTATT-3'）、si-2（5'-GGAGCAAGTCTTTCTAGATAA-3'）；（2）sh-Control组：转染阴性对照序列（5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3'）；（3）空白组：不作任何处理。转染后继续培养48 h。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测MUC16 mRNA表达 取各组转染后培养48 h的U2OS细胞，胰蛋白酶消化，加入细胞裂解液，采用Trizol提取试剂提取总RNA，采用UV-1801紫外/可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）检测纯度和浓度，以吸光度（A）260nm/A280nm比值＞1.80为合格。采用逆转录试剂将RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA为模板进行扩增。PCR条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，36个循环；74 ℃延长3 min。每份样本设6个复孔。MUC16上游引物为5'-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA- 3'，下游引物为5'-ACCAGTGGGCATTCCAGAAAGAGA-3'；β-actin上游引物为5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'，下游引物为5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3'。采用2-ΔΔCt法计算MUC16 mRNA相对表达量。

1.2.3 U2OS细胞增殖活性检测 采用MTT法检测U2OS细胞增殖活性。取各组U2OS细胞，胰蛋白酶消化，接种于96孔板，密度为5 000个/孔，继续培养，分别于12、24、48、72和96 h时每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），继续培养4 h，小心弃去培养液，加入150 μL DMSO，充分振荡5 min，使结晶充分溶解后，采用DP-6100型酶标仪测定各孔490 nm波长处的A值。重复3次。

1.2.4 细胞迁移实验 取各组转染后培养48 h的U2OS细胞，胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液冲洗3次，离心取沉淀，用不含血清的培养液重悬，取200 μL（约1×105个细胞）置于Transwell小室的上室，下室加入含血清的完全培养液600 μL，培养24 h，去除散落细胞，用甲醛固定，结晶紫染色，用CKX53型显微镜（日本 OLYMPUS公司）观察，随机取5个高倍镜视野计数穿膜细胞数。

1.2.5 细胞侵袭实验 取基质胶50 μL，稀释后均匀涂抹在Transwell小室上室，过夜风干备用。其他实验步骤同“细胞迁移实验”。

1.2.6 U2OS细胞MUC16、E-Cad和N-Cad表达 采用免疫印迹法检测U2OS细胞的蛋白表达。取各组转染后培养48 h的U2OS细胞，胰蛋白酶消化，收集U2OS细胞并置于裂解液中，提取总蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量测定。取50 μg总蛋白，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭60 min，分别加入兔抗人MUC16单克隆抗体（1∶500稀释）、兔抗人E-Cad多克隆抗体（1∶1 000稀释）、兔抗人N-Cad单克隆抗体（1∶800稀释），4 ℃过夜孵育，三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗（青岛捷世康生物科技有限公司），室温孵育120 min，采用化学发光法显影，采用Image J图像分析软件（美国国立卫生研究院）进行分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参蛋白，计算MUC16、E-Cad和N-Cad的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组MUC16 mRNA表达比较

sh-MUC16组、sh-Control组和空白组之间MUC16 mRNA相对表达量差异有统计学意义（F=106.005，P＜0.001）。sh-MUC16组MUC16 mRNA相对表达量（0.33±0.09）显著低于sh-Control组（1.03±0.12）和空白组（1.00±0.07）（P＜0.05），而sh-Control组与空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组细胞增殖活性比较

sh-MUC16组培养24、48、72和96 h细胞增殖活性（A值）低于sh-Control组和空白组（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组培养不同时间细胞增殖活性（A值）比较

图1 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组培养不同时间细胞增殖活性（A值）比较

2.3 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组细胞迁移和侵袭能力比较

sh-MUC16组迁移和侵袭细胞数均低于sh-Control组和空白组（P＜0.05）。见表2、图2和图3。

表2 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组细胞迁移和侵袭细胞数比较

图2 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组细胞迁移情况（×200）

图3 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组细胞侵袭情况（×200）

2.4 sh-MUC16组、sh-Control组和空白组MUC16、E-Cad和N-Cad表达比较

sh-MUC16组MUC16和N-Cad相对表达量均低于sh-Control组和空白组（P＜0.05），E-Cad相对表达量高于sh-Control组和空白组（P＜0.05）。sh-Control组与空白组之间MUC16、E-Cad和N-cad相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3、图4。

表3 3个组MUC16、E-Cad和N-Cad相对表达量比较

图4 3个组MUC16、E-Cad和N-Cad表达免疫印迹图

3 讨论

骨肉瘤是一种起源于间充质细胞的恶性肿瘤，临床目前以手术切除辅以化疗的综合治疗方案为主，但复发率、转移率高[8]。随着分子生物学技术的发展，从分子生物学角度寻找与骨肉瘤发生、发展相关的敏感基因，为肿瘤的早期诊疗及改善预后提供了新的方向。

黏蛋白作为一种高相对分子质量、高度糖基化的蛋白，参与了疾病的发生、发展，且与肿瘤发生密切相关[9]。MUC16蛋白是黏蛋白家族中最大的一种，定位于人染色体19p13.2，其阳性表达可促进胆囊癌的发生，与胆囊癌的恶性程度和浸润程度密切相关，可作为胆囊癌的标志物[10]。另外，MUC16还与多种肿瘤相关，可促进肺腺癌细胞侵袭转移[11]，也可作为卵巢癌重要的免疫治疗靶基因[12]。本研究通过转染干扰序列的方法特异性沉默U2OS细胞中MUC16基因的表达。结果显示，sh-MUC16组MUC16 mRNA和蛋白表达量均低于sh-Control组和空白组（P＜0.05），说明sh-MUC16组MUC16表达被成功抑制。有研究结果显示，MUC16过表达可赋予上皮来源的肿瘤细胞抗凋亡的能力[13]。本研究结果显示，sh-MUC16组培养24、48、72和96 h细胞增殖活性低于sh-Control组和空白组（P＜0.05），说明沉默U2OS细胞的MUC16基因表达可抑制细胞增殖活性，提示MUC16可能参与了骨肉瘤细胞的增殖过程。KANWAL等[14]发现，MUC16基因过表达可促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，sh-MUC16组迁移和侵袭细胞数均低于sh-Control组和空白组（P＜0.05），说明沉默U2OS细胞中的MUC16基因表达可抑制细胞迁移和侵袭，提示MUC16与骨肉瘤细胞迁移和侵袭有关。

目前，关于MUC16参与恶性肿瘤发生、发展的机制研究较多。SHEN等[15]的研究结果显示，MUC16通过Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号转录和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化介导的环氧合酶-2表达增强了宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。李新等[16]的研究结果表明，MUC16通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节胆囊癌细胞的增殖和迁移。MUC16的C'端通过与β-连环蛋白的相互作用激活Wnt信号通路，促进肿瘤的发生和转移[17]。上皮-间质转化在骨肉瘤细胞的增殖、侵袭中发挥了重要作用[18]，而在这个过程中，上皮标志物E-Cad表达减少，间充质标志物N-Cad表达增多，从而使骨肉瘤细胞的迁移能力更强[19]。本研究结果显示，sh-MUC16组N-Cad相对表达量低于sh-Control组和空白组（P＜0.05），而E-Cad相对表达量高于sh-Control组和空白组（P＜0.05），说明沉默U2OS细胞中的MUC16基因表达可抑制上皮-间质转化。

本研究尚有不足之处：（1）未设计干扰后恢复表达的实验；（2）仅选用了1株细胞，未用第2株骨肉瘤细胞进行验证；（3）未深入探讨MUC16的具体作用过程及涉及的信号通路。下一阶段将开展多株骨肉瘤细胞的研究，同时对可能涉及的机制开展进一步的验证性研究。

综上所述，沉默U2OS细胞中的MUC16基因表达可抑制细胞增殖活性，减少细胞迁移和侵袭，其机制可能与抑制上皮-间质转化有关。