全外显子家系测序在WDR35基因复合杂合变异导致SRPS-5胎儿产前诊断中的价值

赵旭亮， 田瑞霞， 施友文， 俞 敏， 焦鎏鎏， 朱复希

（1.安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心，安徽 合肥 230022；2.中国人民解放军联勤保障部队第901医院妇产科，安徽 合肥 230031；3.中国人民解放军联勤保障部队第901医院影像科，安徽 合肥 230031）

骨骼纤毛类疾病是一类以骨骼系统异常为主要表现的罕见疾病，是由调控初级纤毛结构或功能的基因缺陷导致的，包括短肋-多指综合征（short-rib polydactyly syndrome，SRPS）、软骨外胚层发育不良症（chondroectodermal dysplasia，EVC）、窒息性胸廓营养不良（asphyxiating thoracic dysplasia，ATD）或Jeune综合征、Sensenbrenner综合征和颅骨外胚层发育不良（cranioectodermal dysplasia，CED），其中围产期致死性SRPS的病情最为严重[1]。WDR35基因缺陷可导致伴或不伴多指（趾）畸形短肋胸椎发育不良7型（short-rib thoracic dysplasia 7，SRTD7；OMIM#614091），又被称为短肋-多指综合征5型（SRPS-5），属于SRPS中较为罕见的亚型。SRPS主要表现为胸廓狭窄、伴四肢长骨明显短小及多指（趾）畸形，不同亚型间临床表现常有重叠，因此不易鉴别[2-3]。本研究采用全外显子家系测序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES）诊断1例SRPS-5引产儿，并分析其临床特征和遗传学特点。

1 材料和方法

1.1 研究对象

引产儿母亲30岁，孕4产2，本次妊娠为宫内孕、单胎。否认近亲婚配，体健，且无不良嗜好，否认孕前特殊病史及围孕期因素暴露史。曾有2次胚胎停育史，1次引产史（孕足月因胎儿畸形考虑四肢短小引产，具体情况不详）。本次妊娠再次因胎儿“四肢短小”于孕22+3周就诊于中国人民解放军联勤保障部队第901医院。产前超声检查示胎儿颈后透明带厚度1.2 mm，双顶径52 mm（孕22周水平），头围193 mm（孕21+4周水平），腹围172 mm（孕22+2周水平），股骨长19 mm（孕15+4周水平），肱骨长22 mm（孕16+5周水平），胫骨长16 mm，足长36 mm，胎儿心率151次/min，心率齐。胎儿长骨明显较短，且骨干弯曲，股骨干骺端粗大，呈“电话听筒”状；胸腔狭窄且胸围较小，心胸比值为0.43，肋骨短且双肺受压变小；腹部膨隆，胸腹移行处有分界，移行处腹侧增大。超声诊断胎儿骨骼发育不良，结合胎儿母亲不良妊娠史，考虑致死性侏儒Ⅰ型。胎儿母亲及其家属选择于孕23周引产终止妊娠。引产儿体征与超声结果相符。电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）三维重建提示长骨及骨干发育不良，肋骨短且胸腔狭窄，但头颅、手及足部发育正常。见图1。

图1 本例胎儿引产前、后的影像学检查结果

1.2 方法

1.2.1 基因检测 本研究经中国人民解放军联勤保障部队第901医院伦理委员会审批通过（伦理申请号：202106002），孕妇及其家属签署知情同意书。取引产儿皮肤组织约2 g，置于RNAlater保护管中，同时采用乙二胺四乙酸抗凝管采集其父母外周血3 mL。行全外显子家系测序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES），根据基因组提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）说明书要求提取DNA。将目标区域DNA片段进行富集，构建覆盖人类基因组全外显子文库，采用NovaSeq 6000测序仪（美国Illumina公司）对其进行高通量测序，目标序列覆盖度≥99%。

1.2.2 数据处理与位点验证 测序数据经质控过滤后，将序列与GRch37/hg19参考基因组进行比对，对在各数据库（dbSNP、千人基因组及ExAC）中筛选出的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点、插入及缺失变异进行检索，查看其在正常人群中的分布频率。采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及Mutation Taster（https：//www.mutationtaster.org/）蛋白结构预测软件对错义突变进行危害性分析。根据美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南[4]进行变异位点评级。采用Sanger测序验证WDR35基因可疑致病变异位点，采用3730XL测序仪（美国ABI公司）对扩增产物进行测序，并采用DNASTAR 5.0软件（美国DNASTAR公司）进行分析。WDR35基因缺失验证：在缺失区域上、下游各设计1个对照扩增子，常染色体与X染色体各设计1个对照扩增子，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）进行DNA相对定量分析。

1.2.3 变异保守性分析及结构预测 在美国国立生物技术信息中心数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）搜索WDR35蛋白序列（NM_001006657），采用Mega 7.0软件（新西兰Mega有限公司）对变异位点进行保守性分析，并进行多物种同源比对。采用Swiss-Model在线平台（https：//swissmodel.expasy.org/）查询与WDR35蛋白序列相似的三维晶体结构，以酵母β-COP结构为模板（PDB编号：3mkqA）[5]，采用DeepView软件（瑞士生物信息研究院）进行可视化分析，在正常WDR35蛋白三维模型上对定点突变位点（p.Val267Met）进行局部展示。

2 结果

2.1 基因检测结果

Trio-WES结果显示，胎儿WDR35基因发生复合杂合变异，分别为父亲携带的c.799G＞A/p.Val267Met杂合变异和母亲携带的chr2：20151176-20151245杂合缺失，dbSNP数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库均未收录这2个变异。Sanger测序结果显示存在c.799G＞A/p.Val267Met变异。RT-qPCR结果显示母亲携带chr2：20151176-20151245杂合缺失，该缺失区域包含WDR35基因第14号外显子序列。引产儿家系图见图2。引产儿及其父母WDR35基因变异分析结果见图3。

图2 引产儿家系图

图3 先证者（引产儿）及其父母WDR35基因变异分析

采用SIFT、PolyPhen-2及Mutation Taster在线分析软件对c.799G＞A/p.Val267Met的生物危害性进行预测分析，结果分别为0.002（damaging）、0.791（possibly damaging）、1（disease causing），提示变异可能影响蛋白功能。检索HGMD及PubMed数据库，未发现关于该变异的报道，属于WDR35基因新变异。根据ACMG指南，将c.799G＞A/p.Val267Met评级为可能致病（like pathogenic），评级证据为PM1+PM2+PM3+PP3。chr2：20151176-20151245杂合缺失为功能缺失型（loss of function，LOF）变异，可能导致基因功能丧失，ACMG将该变异评级为可能致病（like pathogenic），评级证据为PVS1+PM2。

2.2 同源性比对和结构预测结果

同源性比对结果显示，WDR35蛋白Val267在不同物种之间高度保守。见图4。

图4 不同物种之间WDR35蛋白的同源性分析

通过Swiss-Model在线平台对WDR35蛋白同源进行建模，结果显示，WDR35蛋白Val267位于WD40蛋白N'-端7个紧密相连的β-螺旋桨状结构域，该结构域起着蛋白识别及运输等功能。当p.Val267Met发生变异，即与Val286、Gln287形成额外氢键时，可能导致局部空间改变。见图5。

图5 蛋白结构预测分析结果

3 讨论

短肋胸椎发育不良（short-rib thoracic dysplasia，SRTD）是以肋骨短小及胸廓狭窄为主要表型的一类综合征，可合并多指（趾）畸形等。伴或不伴多指（趾）畸形SRTD有22种亚型（www.omim.org/phenotypicSeries/PS208500）。SRTD分类主要为SRPS、ATD及Mainzer-Saldino综合征（OMIM#266920）等[6]，其中SRPS由初级纤毛功能缺陷和/或纤毛蛋白调节的细胞信号通路受损所致[7]，根据不同致病基因共分为5种亚型，WDR35基因变异引起的SRPS-5于2011年被首次报道，该亚型为一种常染色体隐性遗传疾病，其主要临床特征为严重的四肢短小伴弯曲、窄胸及多指（趾）畸形、髋臼顶呈“三叉戟”状，非骨骼系统表型包括唇腭裂及其他器官畸形，如肾囊肿及偏侧性缺陷[2，4]。本例SRPS-5胎儿具有四肢长骨明显短小且弯曲，窄胸伴肺发育不良等SRPS典型临床特征。另外，在胎儿母亲既往孕史中，有1次因产前超声提示胎儿四肢短小而引产的情况，具体临床信息不详，可能同样因WDR35基因缺陷所致。

值得注意的是，WDR35基因缺陷除可导致SRPS-5外，也是CED-2的致病基因。CED-2患儿出生后即可观察到其特殊面容，包括额头隆起、双侧颞部狭窄、低耳位或向后旋转的外耳廓、内眦褶、小下颌及鼻孔前倾等。由于变异导致外胚层发育受限，CED-2患儿主要临床特征为颅缝早闭、短指及牙齿、头发、指甲等外胚层组织异常，虽也表现为四肢短小（尤其是肱骨）和胸廓狭窄，但严重程度明显弱于SRPS-5，且有非胚胎期致死的特征[8]。SRPS-5患儿出现严重表型可能与WDR35基因发生LOF变异有关，既往报道的SRPS-5病例中，至少有1个WDR35等位基因发生移码变异或非编码区变异导致的转录异常[5，9-10]。然而，CED-2患者WDR35基因多数为错义变异导致蛋白功能受损[11-14]，由于该基因变异相关报道较为罕见，因此能否利用变异类型鉴别2种疾病的效能，仍需更多队列研究进行验证。

根据致病基因可将SRPS分为5种亚型，每种亚型的表型相似，通过超声进行产前诊断具有一定的困难，每种亚型均可导致特定疾病。由DYNC2H1基因变异导致的SRPS-1或SRPS-3又被称为Saldino-Noonan综合征或Verma-Naumoff综合征（OMIM#613091），是最常见的SRPS亚型，约占SRPS患者数的50%[8]。SRPS-1的特征为肢体极度短小（鳍状肢体）、胸廓狭窄、多指（趾）畸形、肩胛骨发育不全和多器官受累等，是最严重的SRPS亚型；SRPS-3与SRPS-1表型相似，患儿四肢短小、胸廓狭窄、颅底短缺、前额突出和枕部平坦的特征较明显[15-16]。NEK1基因变异导致的SRPS-2又被称为Majewski综合征（OMIM#263520），患儿特征为长骨干骺端光滑，胫骨较腓骨短，多指（趾）畸形较为普遍[17]。IFT122基因变异导致的SRPS-4又被称为Beemer-Langer综合征（OMIM#269860），与SRPS-2表型相似，均可表现出长骨短且干骺端光滑[18]，长骨严重弯曲（特别是桡骨与尺骨）、腓骨纤薄、小髂骨也是其临床特征[3]。综合不同亚型的临床表型可以看出，SRPS最显著的临床特征为肋骨短伴四肢长骨明显短小，并可合并多指（趾）畸形，累及多器官。

SRPS的发生主要由细胞纤毛形成及功能缺陷导致，细胞纤毛内转运蛋白（intraflagellar transport，IFT）对建立和维持纤毛结构至关重要。IFT转运过程需要三磷酸腺苷参与，并由大型多蛋白复合物IFT-A和IFT-B控制，WDR35基因编码IFT-A复合体核心区域的IFT121蛋白（另外2个蛋白分别为IFT140、IFT144）[3]，因此WDR35基因缺陷会干扰下游IFT43的稳定性，从而破坏生长板软骨细胞的有序增殖和分化，对软骨内成骨与矿化产生严重影响[19]。WDR35蛋白包括N'-端由7个紧密连接的β-螺旋桨状结构组成的结构域（WD40/WD40样重复结构域），具有细胞内识别、结合及运输蛋白的生物功能，而在C'-端为1个TRP样重复结构域[10，20]。本例引产儿WDR35基因发生复合杂合变异，其中1个源自父亲的错义变异（c.799G＞A/p.Val267Met），位于WD40样重复结构域，通过蛋白结构预测该变异可导致局部生成额外氢键，进而可能影响该结构域的生物功能。MILL等[5]报道了1例具有显著短肢、轴后多指畸形及特殊面容表型的SRPS-5胎儿，胎儿WDR35基因的1个错义突变位点同样出现在高度保守的WD40样重复结构域。提示该结构域功能被破坏可能会导致更严重的疾病表型，但由于目前关于SRPS-5患儿产前研究的报道较少，因此仍需明确其基因型-表型的关联性。

综上所述，产前超声检查虽可识别胎儿发育异常等问题，但许多疾病表型在妊娠后期或产后逐渐发生变化，增加了通过超声进行产前诊断的难度。SRPS不仅在不同亚型间表型相似，而且也与EVC、CED等其他软骨发育不良疾病的产前超声影像特征存在广泛的表型重叠，若不进行基因检测，几乎难以精确诊断。而全外显子基因测序有助于诊断胎儿期疾病。ACMG于2020年发布了胎儿全外显子测序在产前诊断中的应用指南，明确指出，当胎儿超声检查结果异常，并在核型和染色体微阵列检测未见异常的情况下，建议进行Trio-WES[21]。随着测序技术的不断发展和临床数据的不断积累，胎儿全外显子测序技术必将广泛应用于产前精准诊断，并发挥关键作用。