载脂蛋白E基因分型检测室间质量评价计划制定与实施

鲍 芸， 权 静， 张芃胤， 肖艳群

（上海市临床检验中心临床细胞分子遗传学研究室，上海 200126）

载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）为一种多态性蛋白，是低密度脂蛋白受体的配体，在胆固醇和三酰甘油的转运、储存和代谢过程中发挥着重要作用。ApoE基因分型与人体的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平密切相关，不同基因型与高血脂、心血管疾病和阿尔茨海默病的患病风险密切相关，对他汀类药物的降脂效果也有一定的影响。人体内存在的3种ApoE蛋白异构体（E2、E3和E4）是由2个常见的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点rs429358和rs7412共同决定的，这2个位点的碱基变化产生了ε2、ε3、ε4等位基因型[1]，其对应的蛋白异构体分别为E2、E3和E4。ε2、ε3和ε4等位基因在中国人群中的分布频率分别为9.5%、69.9%和15.5%[2]。

有研究结果表明，E2/E2基因型的高血脂患者服用普伐他汀降脂效果更好[3]。在中国人群中，E2基因型高血脂患者对阿托伐他汀和瑞舒伐他汀更敏感，用药后血清总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇水平下降更明显[4-6]。E3携带者是对他汀类药物药效最不敏感的个体[7]。个体化药物基因组学数据库PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine）中将ApoE检测定为2A级，属于药物使用前强烈建议检测的位点[8]。由此可见，ApoE基因分型对指导个体化用药有积极的作用。

目前，我国批准上市的ApoE基因检测试剂盒有7种，检测方法主要涉及荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和基因芯片，临床实验室已逐步开展该项目的检测。检测过程中涉及到血液基因组DNA纯化、特异性PCR扩增、片段杂交、结果分析判定等，任一环节均会影响检测结果的准确性。错误的基因分型结果会影响临床正确选择和使用他汀类药物，降低疗效，甚至危及患者生命。为评估临床实验室ApoE基因检测能力，保证基因分型结果的准确性，本研究将基因组DNA作为质控品，开展ApoE基因分型检测项目的室间质量评价（简称室间质评）计划，以进一步提高临床实验室该项目的检测质量。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2020年上海市临床检验中心ApoE基因检测室间质评计划（2次）参评实验室为36家，其中上海地区25家（公立医疗机构16家，第三方医学检验实验室9家），其他地区11家（公立医疗机构6家，第三方医学检验实验室5家）。

1.2 方法

1.2.1 室间质评物品盘准备 用血液基因组DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取人外周血基因组DNA。使用Sanger测序法（由武汉华因康基因科技有限公司完成）检测ApoE基因rs429358和rs7412位点基因型，确定各基因组DNA相应位点的型别（野生型和不同的突变型），尽量涵盖所有人群基因类型。制备5份能力验证物品，其中2份分型结果一致，其余3份为不同分型物品。用NanDrop超微量紫外可见光分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司）检测基因组DNA的浓度和纯度，用TE缓冲液溶解，浓度约为50 ng/μL，按照每支50 μL分装成5支后，-20 ℃保存（不超过9个月）。5支物品随机编码后，通过冷链发送至各参评实验室。要求参评实验室在规定时间内按照常规物品检测流程进行检测，并将结果通过网络上报至上海市临床检验中心数据库。

1.2.2ApoE基因分型检测室间质评物品性能评价 （1）均一性评价。参照《CNAS-GL003：2018 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[9]要求，在第1次室间质评前，从制备好的能力验证物品中选取1个批号，随机抽取10个室间质评物品，采用ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ThermoFisher Scientific公司）和ApoE基因分型试剂盒（武汉友芝友公司）检测，每个物品重复检测2次。（2）稳定性评价。在每次室间质评物品分发的同时，进行同步稳定性评价。选取3支同一批号的室间质评物品，采用ApoE基因分型试剂盒检测，每支重复检测2次。

1.2.3 室间质评结果评价与分析 依据回报结果计算各参评实验室的得分情况。将2个SNP位点检测基因型和根据基因型判定的分型结果与预期相符的百分率计为该实验室本次室间质评成绩。≥80分判定为室间质评成绩合格。同时，计算总体符合率和不同检测方法的符合率，并与实验室沟通，分析错误检测结果的原因。

2 结果

2.1 室间质评物品验证结果

2020年室间质评物品2个SNP位点的基因型测序结果见图1。2次室间质评物品盘构成及预期结果见表1。

图1 室间质评物品Sanger测序检测图谱

表1 2020年室间质评物品盘构成和检测符合率

采用荧光PCR分析室间质评物品的均一性和稳定性，结果显示，均一性和稳定性检测结果与预期基因分型结果一致，符合率为100%，室间质评物品均一性和同步稳定性满足要求。

2.2 ApoE基因分型检测总体回报情况

2020年ApoE基因检测室间质评计划参评实验室为36家，2次室间质评收到的有效回报结果分别为32份和31份。2次室间质评活动中，参评实验室主要采用荧光PCR法、基因杂交法和Sanger测序法检测，分别占75%（24/32）和18.75%（6/32）、6.25%（2/32）和67.74%（21/31）、25.81%（8/31）和6.45%（2/31）。

2.3 参评实验室检测能力评价结果

2020年2次室间质评中，结果回报完全正确的实验室分别占93.75%（30/32）和100.00%（31/31），总体检测符合率分别为99.38%（318/320）和100.00%（310/310），基因分型判定总体符合率分别为97.5%（156/160）和100.00%（155/155）。错误回报结果主要发生在第1次室间质评中，有1家实验室成绩为80～99分，1家实验室成绩不合格（＜80分）。错误结果包含2个SNP检测错误和4个基因分型结果判断错误。第2次室间质评物品检测总符合率为100.00%，且分型结果判断全部正确。

2次室间质评各检测方法的检测效能比较结果显示，基因杂交法和Sanger测序法检测符合率均为100.00%，错误结果均发生在使用荧光PCR法的实验室。2次室间质评活动中荧光PCR敏感性分别为98.18%和100.00%，特异性均为100.00%。见表2。

表2 不同检测方法参评实验室评价结果 家

3 讨论

随着精准医疗概念的提出和推广，越来越多的个体化药学基因检测项目被应用于临床，大大提高了特定药物的疗效，并减少了药物不良反应的发生。本研究通过组织实施ApoE基因分型检测室间质评计划，对临床实验室相关项目检测质量进行了比较全面的评估，结果显示，2次室间质评中成绩满分的实验室分别占93.75%和100.00%，提示参评实验室总体检测准确率较高。2次室间质评中，2个SNP检测错误和4个基因分型结果判断错误均出现在第1次室间质评中，分别来自2家实验室，1家实验室因2例SNP检测错误直接导致2例基因分型结果判断错误，该实验室所用试剂不是商品化试剂，其使用的荧光PCR是实验室自建方法（laboratory developed test，LDT）。与实验室沟通后，分析其错误原因可能为其LDT所使用的检测试剂性能不稳定，且未完成方法学确认。建议开展LDT检测的实验室从准确性、精确性、参考区间、可报告范围、分析敏感性和特异性等方面完成方法学性能确认[9-10]，日常检测中严格按照LDT的标准操作程序操作，并做好室内质控，以保证检测质量；另1家实验室为2个SNP检测均正确，但基因分型结果判定错误。

2次室间质评不仅可考察了实验室正确检测物品中的变异的能力，还评价了实验室根据2个SNP检测结果判断ApoE分型的遗传学分析能力。ApoE基因分型结果判定是依据2个SNP位点（rs429358和rs7412）的检测结果，SNP检测结果与基因分型对应关系明确，对生物信息学分析能力的要求相对较低，推测实验室错误结果主要原因是检测人员对该项目相关人类遗传学理论知识有所欠缺，提示部分实验室检测人员遗传学分析能力不足，这也是实验室比较薄弱的环节之一。

需要指出的是，在第1次室间质评中出现错误的2家实验室在后续室间质评中物品检测和结果分析全部正确，成绩均为满分。提示实验室通过参加室间质评计划能够发现日常检测中的问题，通过有针对性的分析和内部整改，达到改进质量、提高检测水平的目的。

上海市临床检验中心在我国首次开展了ApoE基因分型检测室间质量评价计划，该计划可客观评价临床实验室ApoE基因检测质量，为帮助临床实验室改进和提高基因分型检测能力，指导临床精准用药提供了有力的保障。