血清尿酸参考测量程序的优化及其在常规系统中的应用

孙江漫， 孟祥兆， 李 敏， 邵 燕， 于洪远

（北京航天总医院检验科，北京 100076）

尿酸作为抗氧化剂，占人体生物体液总抗氧化能力的50%。当存在于细胞质或动脉粥样硬化斑块的酸性/疏水环境中时，尿酸会转化为促氧化剂，促进氧化应激，并通过这种机制参与人类疾病的病理生理过程。尿酸对肾脏的影响包括肾结石和肿瘤溶解情况下的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）。有研究发现，血清尿酸水平升高与心血管疾病之间也存在关联，包括冠心病（coronary heart disease，CHD）、中风、充血性心力衰竭、动脉高血压、心房颤动，以及因心血管疾病导致的死亡风险增加；尿酸升高与心血管疾病、代谢综合征、胰岛素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝和慢性肾病也存在关联[1]。尿酸的测定方法有磷钨酸法、尿酸酶法、高效液相色谱-质谱法。目前，临床实验室测定尿酸主要采用酶法，特异性高、操作较简单。酶法又分为紫外分光光度法和酶偶联法。本研究拟对美国临床化学协会（American Association for Clinical Chemistry，AACC）推荐的血清尿酸参考测量程序（简称参考方法）进行优化，以期为尿酸常规测量系统的建立和溯源提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本

收集4 0份无溶血、黄疸、乳糜的临床剩余单人份血清（尿酸浓度为166.81～1 089.61 μmol/L），用于方法学比较。标准曲线配制采用美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）标准品SRM 913b（99.8%±0.2%），正确度验证采用标准品SRM 909C[（278.57±5.95）μmol/L]和国际比对样本RELA20B、RELA21A。

1.2 主要仪器和试剂

carry100紫外可见分光光度仪（美国安捷伦公司）、ARCHITECT c16000全自动生化分析仪（美国雅培公司）及配套尿酸检测试剂（16043UN20）、校准品（50078FD01）和多项定标液（50078FD01）；美国sigma公司Trisbase（T1503）、Tris-HCl（T3253）、三氯乙酸（T9159）、碳酸锂（62470），北京阿匹斯公司牛血清白蛋白（AC0012B）、瑞士Roche公司尿酸酶（10828475）。

1.3 方法

1.3.1 尿酸参考方法的建立 按照AACC推荐的尿酸酶法，并参考文献[2-3]建立血清尿酸测定参考方法，其原理是尿酸酶可特异性地水解尿酸，生成尿囊素，尿酸在293 nm处有特征性的吸收峰，根据反应前后吸光度的变化测量样本中的尿酸含量。操作流程：（1）将0.5 mL样本、2.5 mL Tris-buffer置于15 mL离心管，在测试管中加入1 mL 0.1 U/L尿酸酶，（37±1）℃水浴60 min；（2）在测试管中加入2 mL 10%三氯乙酸，空白管中加入3 mL 10%三氯乙酸-尿酸酶，放置45 min；（3）将测试管和空白管以1 200×g离心40 min，取上清液，测定293 nm处吸光度值。

1.3.2 尿酸参考方法的优化 对建立的尿酸参考方法进行优化，将最终的反应液以1 200 ×g离心40 min，收集上清，移至新的离心管，再次离心15 min，以更彻底地去除干扰。

1.3.3 正确度验证 采用SRM909C和国际比对样本RELA20B、RELA21A进行正确度验证。

1.3.4 精密度验证 留取高值（701.45 μmol/L）、中值（424.22 μmol/L）、低值（221.34 μmol/L）临床剩余血清样本，每个浓度值每天测定5次，连续5 d。

1.3.5 线性评估 参考方法的线性范围为119.05～1 190.48 μmol/L，留取接近线性范围的高值（1 091.67 μmol/L）、低值（144.05 μmol/L）临床混合血清样本，按照1L、0.8L∶0.2H、0.6L∶0.4H、0.4L∶0.6H、0.2L∶0.8H、1H的方式配置6个浓度梯度，计算各浓度梯度的理论浓度。

1.3.6 方法学比对 采用优化后的参考方法和临床常规测量系统[c16000全自动生化分析仪及配套尿酸检测试剂（16043UN20）、校准品]同时测量40份单人份临床剩余血清样本。比较2种方法检测结果。（1）参考美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP9-A3文件[4]，将参考方法作为参比方法，计算常规方法与参考方法的偏差，以参考方法测定结果为X轴，以2种方法的偏差为Y轴，绘制偏差图，观察2种方法偏差趋势。（2）根据CLSI EP9-A3文件，采用广义极端学生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法进行离群值检验。（3）根据偏差图建立回归分析模型，计算斜率、截距、相关系数、95%可信区间（confidence interval，CI），预估医学决定水平处的偏移，观察其是否在临床可接受范围内。

1.3.7 互换性评价 根据CLSI EP14-A3文件要求[5]，采用参考方法和临床常规测量系统同时测量40份单人份临床剩余血清样本，常规方法使用的校准品穿插其中，绘制偏差图，若2种方法测定结果的偏差恒定，则进行Deming回归；若偏差随浓度增加，则对数据进行对数转换。以参考方法为参比系统，95%预测区间为判断标准[6]，对常规方法使用的校准品进行互换性分析。

1.4 统计学方法

采用MedCalc软件进行离群值检测和passing-bablok回归分析，采用Excel 2019软件进行Deming回归分析和配对t检验。

2 结果

2.1 正确度验证结果

尿酸参考方法优化前后测定SRM 909C、RELA20B、RELA21A的结果均在国际临床化学和检验医学联合会（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）等效限范围内（±3.25%），且SRM909C优化前后的测量结果均在证书范围内[（278.57±5.95）μmol/L]。见表1。

表1 正确度评价结果

2.2 精密度验证结果

优化后的尿酸参考方法的重复性和实验室内精密度均有所提高，优化前的重复性[变异系数（coefficient of variation，CV）为0.19%～1.46%，优化前低值样本实验室内复现性精密度＞2%。优化后的重复性（CV）明显提高（0.05%～0.31%）。实验室内精密度虽然改善不明显，但其低值精密度有很大改善，达到了实验室对精密度的要求（CV＜2%）。见表2、表3。

表2 优化前后重复性（CV）结果 %

表3 实验室内精密度验证结果

2.3 线性评估结果

优化前后的测量结果无明显差异（P=0.76）。优化前的线性相关方程为Y=1.01X-0.08（R2=0.999 6），优化后的线性相关方程为Y=1.00X+0.01（R2=0.999 9），优化后的线性相关性更好，斜率更接近1，截距更接近0。

2.4 方法学比对结果

2.4.1 常规方法与参考方法的偏差 常规方法与参考方法之间差异的变化与浓度成比例，即2种方法间的差异为恒定CV，需对常规方法和参考方法进行passing-bablok回归分析。2种方法偏差图见图1。

图1 常规方法与参考方法的偏差图

2.4.2 离群值检测结果 采用MedCalc软件对2种方法的检测结果进行离群值检验，结果显示无离群值，且服从正态分布。见图2。

图2 常规方法和参考方法百分比差值正态分布图

2.4.3 回归分析结果 常规方法和参考方法passing-bablok回归分析结果显示，常规方法在医学决定水平110、480、640 μmol/L处的预期偏移分别是-15.86%、-2.03%、-1.01%，其中110 μmol/L处的偏移超过临床可接受范围（4.50%）[7]，且随样本浓度的增大而减小。见图3。

图3 常规方法与参考方法的Passing- bablok回归分析

2.5 互换性评价结果

根据CLSI EP14-A3文件要求，通过40份单人份临床剩余血清样本对常规测量系统中使用的校准品进行互换性分析，结果显示，2种方法测定结果的偏差为恒定CV，即差异随浓度而变化，需对结果进行对数转换，再进行互换性分析。校准品1和2均超出95%可信区间，其在参考方法和常规方法中没有互换性。见图4。

图4 常规方法校准品互换性分析

3 讨论

随着全自动化生化分析仪和相关检测试剂的多样化发展，临床实验室相关项目的检测效率和精密度都有所提高。但是由于系统的多样性、系统组合的随意性，以及部分临床实验室没有注意校准的溯源性，导致检测结果的差异越来越大。检测结果的标准化是实现不同实验室相同项目检测结果准确、可比的最有效的措施，量值溯源是实现标准化的重要方法之一。国际组织一般通过建立参考方法、研制参考物质和一致性方案来解决量值溯源的问题[8]。本研究通过优化血清尿酸参考方法，并与常规测量系统进行方法学比对，为尿酸常规测量系统的建立和溯源提供参考。

本研究分析了国际一级标准物质SRM909C和国际比对样本RELA20B、RELA21A的尿酸测定结果，发现优化后的尿酸参考方法不会导致测量结果不正确，且优化后的重复性有明显提高，实验室内精密度也有所改善，其中低值样本的精密度达到了实验室的要求（CV＜2%）；优化后的线性相关性更好；提示优化后的尿酸参考方法对正确度无影响，且有更好的精密度和线性相关性。

CLSI推出的新版EP9-A3文件是临床实验室进行方法学比对和偏移评估的重要指南。本研究参考CLSI EP9-A3文件对优化后的参考方法与常规测量系统进行方法学比对，结果显示，在110 μmol/L处的预期偏移为-15.86%，明显超过尿酸的临床可接受范围（4.5%），原因可能是参考方法的线性范围为119～1 190 μmol/L，无法与常规方法线性范围（55.92～1 970.24 μmol/L）重叠，即没有覆盖医学决定水平低值（110 μmol/L），无法对常规测量系统低值样本进行比较。另外，本研究参考EP14-A3文件对常规方法使用的校准品进行了互换性分析，发现2个浓度水平的校准品在2种方法之间没有互换性，这可能也是医学决定水平低值样本的预期偏移较大的原因；还有可能是2种方法的检测原理略有不同，参考方法的原理是尿酸酶可特异性地将尿酸水解，生成尿囊素，尿酸在293 nm处有特征吸收峰，而尿囊素没有，根据反应前后吸光度的变化可定量样本中尿酸的含量；而常规方法的原理是尿酸经尿酸酶氧化生成尿囊素，同时生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和N-（3-磺丙基）-3-甲氧基-5-甲基苯胺反应生成一种醌亚胺染料，604 nm处吸光度的改变与样本中尿酸的浓度成正比。

综上所述，优化后的血清尿酸参考方法精密度和线性更好，可以为临床常规方法的建立和溯源提供一定的参考。临床实验室在建立尿酸常规方法时需重视测量方法的原理和校准品的溯源。