EUCAST和CLSI微量肉汤稀释法白念珠菌体外药物敏感性试验结果比较

张亚茹， 凌丽燕， 陈 敏

（1.平湖市第二人民医院检验科，浙江 平湖 314201；2.海军军医大学第二附属医院皮肤科，上海 200003）

近年来，深部真菌感染的发病率呈明显上升趋势，患者病死率占住院患者病死率的40%～60%，深部真菌感染引起的侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）已成为威胁免疫功能低下患者生命安全的主要因素之一[1-2]。念珠菌病是由念珠菌属，尤其是白念珠菌（Candida albicans）引起的一种真菌病，该病原菌既可侵犯皮肤和黏膜，又能累及内脏，引发侵袭性或深部器官念珠菌病，如念珠菌血症、慢性播散性或肝脾念珠菌病、心内膜炎[3]。另外，由于广谱抗菌药物、抗癌药物、免疫抑制剂的泛用和侵入性诊疗操作、器官移植的广泛开展，以及人口老龄化等原因，念珠菌病的发病率大大增高，已成为临床常见侵袭性真菌感染性疾病，该病进展迅速、诊断困难，患者预后差，非治疗患者死亡率＞90%，由白念珠菌引起的侵袭性念珠菌病已成为院内获得性感染的第四大病因[4]。目前，临床对念珠菌病的治疗依然是首选使用药物[5-7]。在念珠菌病高危和发病人群中，使用抗真菌药物进行预防和经验治疗，在某些情况下，因抗真菌药物之间存在交叉耐药性，使得真菌耐药情况日益严重，是临床治疗失败的主要原因之一[8-9]。随着被感染患者的增多，抗真菌药物使用范围的扩大，以及真菌耐药性的变迁，对念珠菌进行与临床相关的、可重复的抗真菌药物敏感性试验的需求日益增多。念珠菌体外药物敏感性试验方法主要有微量肉汤稀释法、比色法、纸片扩散法和浓度梯度扩散法等。2020年，美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和欧洲抗菌药物敏感试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST ）均发布了最新的微量肉汤稀释法用于酵母菌体外药物敏感性试验[10-13]。2种方法在操作上存在一些差异，但对念珠菌体外药物敏感性试验结果有无差异，鲜有报道。本研究分别采用EUCAST方法和CLSI方法检测白念珠菌对8种常用抗真菌药物的敏感性，分析2种方法检测结果的差异，为临床实验室的实际应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株收集和鉴定

收集2018—2019年上海市医学真菌分子生物学重点实验室菌株库保存的42株分离自临床送检肺泡灌洗液、穿刺液、引流液和清洁中段尿等体液样本的白念珠菌非重复株。所有菌株均采用发法国生物梅里埃公司基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定和复核，不一致结果采用真菌ITS DNA序列分析进行确认。质控菌株近平滑念珠菌（ATCC 22019）和克柔念珠菌（ATCC258）标准菌株由上海市医学真菌分子生物学重点实验室菌库提供。

1.2 方法

1.2.1 制备菌悬液 将保存于-80 ℃的目标菌株复苏，于PDA平板[PDA培养基（粉末）购自英国Oxoid公司]35 ℃培养48 h后传代，再继续培养24 h。选取直径≥1 mm的菌落5个，悬浮于5 mL灭菌0.9%NaCl溶液中，涡旋震荡15 s，调整菌悬液浓度至0.5麦氏浊度，制备成浓度为（1～5）×106CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 制备接种悬液 （1）EUCAST方法：将制备的0.5麦氏浊度的菌悬液用含2%葡萄糖的RPMI-1640培养基（美国ThermoFisher Scientific公司）1∶5稀释，制备成2倍终浓度为（2～10）×105CFU/mL的接种悬液。（2）CLSI方法：将制备的0.5麦氏浊度的菌悬液用含0.2%葡萄糖的RPMI-1640培养基1∶100稀释，再1∶10稀释，制备成2倍终浓度为（1～5）×103CFU/mL的接种悬液。

1.2.3 体外药物敏感性试验 根据EUCAST和CLSI相关文件[10-13]，选用8种抗真菌药物（两性霉素B、阿尼芬净、卡泊芬净、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬净、泊沙康唑和伏立康唑）进行体外药物敏感性试验。（1）EUCAST要求：用含2%葡萄糖的RPMI-1640培养基稀释抗真菌药物至2倍终浓度（氟康唑为0.125～64 mg/L，其他7种抗真菌药均为0.008～4 mg/L）。（2）CLSI要求：用RPMI-1640培养基将抗真菌药物稀释至上述浓度；铺96孔板（美国Costor公司），每横排为1种药物，按照2倍浓度梯度稀释抗真菌药物，每孔各加入100 μL抗真菌药物和100 μL菌悬液，每种药物至少进行1次重复。设定阴性对照和阳性对照孔。EUCAST方法使用平底96孔板，CLSI方法使用U形底96孔板进行孵育。

1.2.4 结果判读 将包被好的96孔板置于微生物培养箱，35 ℃培养24 h。EUCAST方法结果根据450 nm处最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行判读，CLSI方法结果通过肉眼观察到的真菌生长情况进行判读。所有试验均重复2次，以保证数据的有效性。判读标准：对比生长对照，两性霉素B判读点为完全抑制或显著减少（抑制率≥50%）；其他7种药物MIC为对应的MIC值，MIC超出试验范围的按最高试验浓度2倍记录，低于试验范围则按最低试验浓度记录。

1.2.5 结果分析 比较2种方法的基本一致性（essential agreement，EA）、分类一致性（categorical agreement，CA）、极重大误差率（very major error，VME）和重大误差率（major error，ME）。EA指2种方法结果相差不超过2个浓度梯度的菌株占所有菌株的百分比；CA指2种方法结果（耐药/中介/敏感）相同的菌株占所有菌株的百分比；VME指2种方法中一种为耐药，另一种为敏感的菌株占所有菌株的百分比；ME是指2种方法中一种为中介，另一种为敏感或耐药的菌株占所有菌株的百分比。以EA≥90%、CA≥95%、VEM≤1.5%、ME≤3%为标准，判定为2种方法结果具有一致性[14-15]。

2 结果

2.1 2种方法MIC值分布

采用EUCAST方法和CLSI方法分别对42株白念珠菌进行体外药物敏感性试验，对照孔中的白念珠菌在U形底和平底96孔板中均生长良好，两性霉素B、阿尼芬净、卡泊芬净、氟康唑、伊曲康唑、米卡芬净、泊沙康唑和伏立康唑的MIC均具有典型性。除EUCAST方法卡泊芬净MIC值高于CLSI方法外，其他7种抗真菌药物EUCAST方法的MIC结果均比CLSI方法的MIC结果低1～2个稀释倍数。EUCAST方法和CLSI方法的总体EA分别为95.2%（氟康唑）、97.6%（米卡芬净）和100.0%（两性霉素B、阿尼芬净、卡泊芬净、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康唑）。见表1。

表1 2种方法检测结果比较

2.2 2种方法一致性分析

CLSI方法尚无白念珠菌两性霉素B、伊曲康唑和泊沙康唑的临床折点，参考流行病学折点区别野生型和非野生型[16]。根据EUCAST和CLSI公布的白念珠菌临床折点（表2），对2种方法检测白念珠菌药物敏感性的一致性进行分析。结果显示，两性霉素B、阿尼芬净和米卡芬净2种方法CA为100%；氟康唑EUCAST方法有4株耐药，2株中介，而CLSI方法这6株菌均为耐药；伏立康唑有1株EUCAST方法为耐药，CLSI方法为中介；泊沙康唑EUCAST方法有4株耐药、1株中介，CLSI方法这5株菌均为耐药；伊曲康唑有8株2种方法均为耐药。见表3。

表2 CLSI和EUCAST微量肉汤稀释法白念珠菌抗真菌药物敏感性折点

表3 CLSI和EUCAST方法白念珠菌药物敏感性试验结果一致性分析

3 讨论

本研究分别采用EUCAST和CLSI推荐的微量肉汤稀释法分析了42株白念珠菌对8种临床常用抗真菌药物的药物敏感性，结果显示，除卡泊芬净外，7种抗真菌药物EUCAST方法的MIC值比CLSI方法的MIC值低1～2个稀释倍数（卡泊芬净EUCAST方法的MIC高于CLSI的MIC），几何均数EUCAST方法也低于CLSI方法，与PFALLER等[16]的研究结果一致，本研究卡泊芬净的结果与PHILIPS等[17]的研究结果差异较大，可能与不同研究选择的方法不同有关。本研究结果显示，2种方法的总体EA和CA均为95.2%～100%，提示2种方法的一致性较好；氟康唑的ME为4.8%，泊沙康唑的VME为2.4%，药物敏感性符合率较差。PFALLER等[16]的研究结果显示，114株白念珠菌2种方法的EA和CA均＜95.2%，伊曲康唑和泊沙康唑的VME分别为7.9%和6.4%，而本研究只有泊沙康唑的VME高于要求的1.5%，相比之下，本研究的一致性更好。

EUCAST和CLSI均已将其抗真菌药物敏感性试验方法标准化，为协调这2种方法的临床折点做出了巨大努力，调整了念珠菌氟康唑的临床折点，减少了2种方法结果的差异[18]；泊沙康唑在体外对白念珠菌的敏感性高于氟康唑，适合用于治疗口咽念珠菌病，但不适用于治疗侵袭性念珠菌病，BEREDAKI等[19]在侵袭性念珠菌病的体外药代动力学/药效学（pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD）模型中探索了泊沙康唑对白念珠菌的疗效，发现其流行病学界值为0.06 mg/L。而EUCAST公布的临床折点也为0.06 mg/L。本研究中，2种方法氟康唑和泊沙康唑的药物敏感性试验结果符合率较差，可能与2种药物在结果判读时使用了相同的折点有关。EUCAST要求的菌浓度为（1～5）×105CFU/mL，CLSI要求的菌浓度为（0.5～2.5）×103CFU/mL，最大浓度相差1 000倍，当使用相同折点判读时，由于培养基成分、微孔板类型，以及判读方式不同，很容易使结果有差异。

卡泊芬净EUCAST折点尚未公布，由于3种棘白菌素之间存在高度交叉耐药性，对阿尼芬净和米卡芬净均为敏感的分离株应被视为对卡泊芬净敏感。对阿尼芬净和米卡芬净（如阿尼芬净敏感和米卡芬净耐药）分类不一致的分离株，应通过耐药基因测序进一步分析[20]。本研究中，阿尼芬净和米卡芬净的敏感性均为100%，与上海地区白念珠菌对棘白菌素类药物的敏感性一致[21]。近年来，有指南[22]已将新型棘白菌素类药物列入念珠菌血症的初始用药（强烈推荐）。

综上所述，尽管EUCAST和CLSI方法对白念珠菌孢子浓度、培养基成分、微孔板类型，以及判读方式有所不同，但本研究结果显示，2种方法白念珠菌体外药物敏感性试验结果具有较好的一致性，但氟康唑和泊沙康唑的药物敏感性符合率未达到要求，可能与本研究参考的折点有关系。不同的临床分离株使用不同的方法对常见抗真菌药物的耐药性基本一致，但少数仍然需要协调，正确的药物敏感性试验结果能够帮助临床实现对念珠菌感染的合理用药，为临床有效诊断、治疗真菌病提供参考。