西地那非对肾缺血再灌注损伤大鼠氧化应激及肾小管细胞凋亡的影响

王可娜，张 娇，徐家云

（河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471000）

肾缺血再灌注损伤（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是诸多疾病及医疗过程如休克、移植等过程产生的病理生理过程，发病机制复杂，其中肾移植过程中RIRI难以避免，可对移植肾的早期及远期功能带来一定影响，严重影响患者预后[1]。目前，临床仍缺乏有效治疗手段对RIRI起到完美保护作用。因此，探寻有效药物治疗RIRI仍是临床研究热点。西地那非是5型磷酸二酯酶抑制剂，对RIRI具有一定保护作用[2]，但具体作用机制尚未阐明。研究[3]表明，RIRI主要病理改变是缺血引起的氧化应激损伤及肾小管细胞凋亡。抑制凋亡相关因子Fas/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Fas/Caspase-8）通路活化可抑制RIRI大鼠肾小管细胞氧化应激凋亡[4]。目前，有关西地那非对RIRI的保护作用是否与调控Fas/Caspase-8通路有关少见报道，因此本研究基于Fas/Caspase-8通路探究西地那非对RIRI大鼠氧化应激及肾小管细胞凋亡的影响，以期为临床有效防治RIRI改善肾移植患者预后提供一定参考。

1 主要材料与试剂

1.1 实验动物

40只SPF级SD雄性大鼠（10周龄），体质量180～240 g，平均体质量（213±27）g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0009。

1.2 主要试剂与仪器

盐酸西地那非，国药准字H20143255，购自广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂；苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色试剂盒，购自北京百瑞极生物科技有限公司；原位末端标记（TdT-mediateddUTPnickandlabeling，TUNEL）试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量检测试剂盒均购自南京建成生物研究所；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，购自上海梵态生物科技有限公司；兔抗鼠凋亡相关因子Fas、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）及β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、山羊抗兔HRP二抗，均购自上海研卉生物科技有限公司。

Optima™XPN超速离心机，购自贝克曼库尔生物科技有限公司；BD-SW50光学显微镜，购自深圳市博视达光学仪器有限公司；MouseDoppler型小动物超声多普勒血流仪，购自技尔（上海）商贸有限公司；Atellica CH930型全自动生化分析仪及配套试剂，购自上海聚慕医疗器械有限公司。

2 实验方法

2.1 分组及模型建立[5]

将大鼠随机分为假手术组、模型组及西地那非低、中、高剂量组，每组8只。模型组及西地那非低、中、高剂量组腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，背部皮肤消毒，切开腰背筋膜，分离肾周围组织，暴露双侧肾脏，以无创动脉夹夹闭双侧肾蒂血管，45 min后松动无创动脉夹恢复血流再灌注（以小动物超声血流仪未监测到血流为缺血标志，以监测到血流为再灌注成功标志），之后逐层缝合皮肤，假手术组大鼠除不夹闭肾蒂血管外，其余操作同模型组。再灌注后，西地那非低、中、高剂量组立即腹腔注射25 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1、75 mg·kg-1·d-1的盐酸西地那非溶液[6]，连续2周；假手术组和模型组同时间腹腔注射等量生理盐水。

2.2 标本采集

第2周末收集各组24 h尿液标本；于末次腹腔注射给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，收集尾静脉血2 mL。以上所收集的样本均离心10 min（3 000 r·min-1，离心半径8 cm），取上清液，保存于-80℃冰箱，用于测定24 h尿蛋白及血肌酐水平。各组取血结束后，断颈处死并取肾脏组织分为两部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片，厚6 μm，用于HE染色及TUNEL法检测；另一部分保存于液氮中，用于氧化应激水平测定及免疫印迹法蛋白检测。

2.3 测定各组肾功能指标水平[7]

取2.2尿液及血清标本，采用全自动生化分析仪及配套试剂测定24 h尿蛋白、血清中血肌酐水平。

2.4 HE染色观察各组肾组织病理学变化[8]

取2.2各组部分肾脏组织切片，梯度乙醇脱蜡、复水，之后进行HE染色，以中性树胶封片，光学显微镜下观察组织病理学变化，并拍照。

2.5 TUNEL技术检测各组肾小管细胞凋亡情况[9]

取2.2剩余肾脏组织石蜡切片常规脱蜡、水化，PBS洗涤2遍后，加入末端脱氧核苷酰转移酶反应缓冲液处理10 min，37℃加入末端脱氧核苷酰转移酶反应混合物反应1 h，最后加入3，3’-二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）反应显色，苏木精复染，光学显微镜观察并拍照，细胞核呈棕色或棕褐色为凋亡细胞。每高倍镜下随机选取5个视野，计算凋亡细胞数和肾小管细胞总数，取平均值，计算凋亡指数（apoptosis index，AI），AI=凋亡细胞数÷肾小管细胞总数×100%。

2.6 检测各组肾组织中氧化应激水平[10]

取2.2部分肾脏组织，并制备组织匀浆，离心10 min（3 000 r·min-1，离心半径8 cm），取上清液，采用比色法测定SOD活性、MDA含量，采用ELISA法检测GSH-px含量，以上操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.7 免疫印迹法检测各组肾组织中Fas/Caspase-8通路蛋白水平[11]

取2.2大鼠剩余肾脏组织，制备组织匀浆，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，离心10 min（10 000 r·min-1，离心半径8 cm）取上清，测定蛋白总量并取20 μg与等量上样缓冲液混匀，变性、电泳、转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗，之后加入Fas、Caspase-8内参及β-actin作为一抗（1:500），4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入山羊抗兔二抗（1:1 000），37℃ 1.5 h，显影、定影，按照各基因蛋白条带灰度值计算各目标基因蛋白相对表达量。

2.8 统计学方法

用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组肾功能指标水平比较

见表1。

表1 各组肾功能指标水平比较（±s，n= 8）

表1 各组肾功能指标水平比较（±s，n= 8）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西地那非低剂量组比较，▲P＜0.05；与西地那非中剂量组比较，□P＜0.05

组别 Dose/（mg·kg-1）血肌酐/（μmol·L-1）假手术组 - 0.28±0.05 35.03±5.26模型组 - 3.95±0.60# 81.59±12.25#西地那非低剂量组 25 2.88±0.45#△ 62.08±9.32#△西地那非中剂量组 50 1.32±0.19#△ 51.17±7.69#△▲西地那非高剂量组 75 0.85±0.13#△▲ 42.37±6.36#△▲□尿蛋白/（mg·d-1）

3.2 各组肾组织病理学变化

假手术组肾脏组织肾小球及肾小管结构正常，未见炎性细胞浸润；模型组肾脏组织间质充血、水肿，有大量炎性细胞浸润，肾小管肿胀且小管上皮细胞形态异常，刷状缘紊乱消失，管腔内可见脱落的小管上皮细胞；相比于模型组，西地那非低、中、高剂量组病理损伤有所减轻，间质出血减少，水肿减轻，炎性细胞浸润减少，且西地那非剂量越高则上述病理变化越有所改善。见图1。

图1 各组肾组织病理学变化（HE染色，×200）

3.3 各组肾小管细胞凋亡情况比较

见表2、图2。

图2 各组肾小管细胞凋亡情况比较（HE染色，×200）

表2 各组肾小管细胞凋亡情况比较（±s，n= 8）

表2 各组肾小管细胞凋亡情况比较（±s，n= 8）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西地那非低剂量组比较，▲P＜0.05；与西地那非中剂量组比较，□P＜0.05

组别 Dose/（mg·kg-1） 细胞凋亡率/%假手术组 - 1.91±0.25模型组 - 7.26±1.09#西地那非低剂量组 25 6.01±0.91#△西地那非中剂量组 50 4.97±0.75#△▲西地那非高剂量组 75 2.85±0.43#△▲□

3.4 各组肾组织氧化应激水平比较

见表3。

表3 各组肾组织氧化应激水平比较（±s，n= 8）

表3 各组肾组织氧化应激水平比较（±s，n= 8）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西地那非低剂量组比较，▲P＜0.05；与西地那非中剂量组比较，□P＜0.05

组别 Dose/（mg·kg-1） SOD/（mg·L-1） MDA/（nmoL·L-1） GSH-px/（U·L-1）假手术组 - 7.36±1.11 2.15±0.31 9.27±1.39模型组 - 2.05±0.31# 6.79±1.08# 3.90±0.59#西地那非低剂量组 25 3.16±0.47#△ 5.11±0.77#△ 5.12±0.78#△西地那非中剂量组 50 4.59±0.68#△▲ 4.02±0.60#△▲ 6.85±1.03#△▲西地那非高剂量组 75 6.03±0.91#△▲□ 2.91±0.45#△▲□ 7.95±1.18#△▲□

3.5 各组肾组织Fas/Caspase-8通路蛋白水平比较

见图3、表4。

表4 各组肾组织Fas/Caspase-8通路蛋白水平比较（±s，n= 8）

表4 各组肾组织Fas/Caspase-8通路蛋白水平比较（±s，n= 8）

注：与假手术组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西地那非低剂量组比较，▲P＜0.05；与西地那非中剂量组比较，□P＜0.05

组别 Dose/（μg·mL-1） Fas Caspase-8假手术组 - 0.19±0.03 0.33±0.05模型组 - 1.06±0.16# 1.15±0.18#西地那非低剂量组 25 0.87±0.14#△ 0.87±0.15#△西地那非中剂量组 50 0.53±0.08#△▲ 0.65±0.09#△▲西地那非高剂量组 75 0.28±0.05#△▲□0.43±0.07#△▲□

图3 各组肾组织Fas/Caspase-8通路蛋白水平比较

4 讨论

血肌酐是人体肌肉代谢产物，其浓度变化能反映肾小球滤过率，滤过能力下降，则血肌酐浓度升高。肾功能损伤的关键因素之一是分泌大量尿蛋白，其中24 h尿蛋白检测是测验尿蛋白的有效方式[12]。与假手术组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平均升高，但经低、中、高剂量西地那非药物处理后，大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平降低。说明西地那非对RIRI肾功能具有一定保护作用。

病理状态下氧自由基生成-清除平衡被破坏，细胞内SOD活性降低，细胞结构收到破坏，生成大量MDA，检测细胞外SOD活性和MDA含量可以反映细胞氧化应激损伤程度[13-14]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组肾组织SOD、GSH-px水平降低，MDA水平升高，当经低、中、高剂量西地那非药物处理后，大鼠肾组织SOD、GSH-px水平升高，MDA水平降低。说明西地那非能够对RIRI发挥保护作用，可能与抑制肾组织氧化应激反应有关。

肾小管细胞凋亡在RIRI发生发展过程中发挥着关键作用。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组肾小管细胞AI水平升高，当经低、中、高剂量西地那非药物处理后，大鼠肾小管细胞AI水平降低。说明西地那非能够对RIRI发挥保护作用，可能与抑制肾小管细胞氧化应激损伤有关。

氧化应激在细胞凋亡中有重要作用，研究[15]表明，活性氧簇可以促使线粒体释放细胞色素C，激活Fas，进而激活Caspase-8，促使细胞发生凋亡。抑制Fas/Caspase-8通路活化可对RIRI发挥保护作用。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组肾组织Fas、Caspase-8蛋白水平升高，但经低、中、高剂量西地那非药物处理后，大鼠肾组织Fas、Caspase-8蛋白水平降低。说明西地那非可能通过抑制RIRI大鼠肾组织氧化应激反应，抑制Fas/Caspase-8通路活化，进而抑制肾小管细胞凋亡，对RIRI发挥保护作用。

综上所述，西地那非对RIRI大鼠肾脏发挥保护作用，可能是通过抑制RIRI大鼠肾组织氧化应激反应，抑制Fas/Caspase-8通路活化，进而抑制肾小管细胞凋亡实现的。本研究可为有效防治RIRI并改善肾移植患者预后提供一定理论依据，然而本研究并未能明确西地那非对Fas/Caspase-8通路的具体调控作用，后期应进行深入探讨。