针刺干预脊髓损伤后神经源性膀胱信号通路研究进展*

韦慧麟，任亚锋，白俊敏，王永福，牛秋妍，陈净

1.河南中医药大学康复医学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第一附属医院康复中心，河南 郑州 450000

脊髓损伤的发病率较高，超过80%的脊髓损伤患者都经历了某种程度的膀胱功能障碍，原因是神经系统损伤，导致神经源性逼尿肌反射异常和括约肌功能不全。目前，脊髓损伤后肾衰竭的病死率已急剧下降，但对神经源性膀胱相关症状的治疗和由该病导致的生活质量下降仍然是临床亟待解决的问题[1]。近年来，信号通路研究逐渐成为脊髓损伤后各种并发症发病机制研究的热点，为神经源性膀胱的治疗提供了新思路。针灸疗法具有功效显著、安全性高、操作简单、成本低的优势，大量研究证实，针刺干预对脊髓损伤所致神经源性膀胱有效[2]。因此，探讨针刺干预脊髓损伤后神经源性膀胱所依赖的信号通路及其作用机制具有重要意义，可以为未来实验研究提供客观的理论依据和实践参考。

1 针刺干预脊髓损伤后神经源性膀胱信号通路

1.1 细胞凋亡信号通路细胞凋亡是继发性脊髓损伤重要的病理生理机制，会造成脊髓组织中多条信号途径中断和局部微环境失衡。细胞凋亡信号通路主要有线粒体凋亡途径(内源性途径)、死亡受体凋亡途径(外源性途径)和内质网途径等。其中，线粒体途径是研究较为透彻的经典凋亡途径，主要活化机制为：线粒体膜间隙中的细胞色素C(cytochrome C，Cytc)凋亡诱导因子等促凋亡蛋白在三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)等的作用下释放至胞浆内，与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)形成多聚复合体，继而激活下游靶蛋白Caspase-3、Caspase-9，最终导致细胞凋亡。目前，针刺干预脊髓损伤后神经源性膀胱主要是通过抑制线粒体途径介导的相关凋亡因子表达，同时借助各通路间的交互关系，共同抑制细胞凋亡，从而促进膀胱功能恢复。

Xu等[3]以电针(疏密波：疏波10 Hz、5 s，密波50 Hz、9 s，20 min，每天1次)次髎、中极、三阴交和大椎穴治疗骶上脊髓损伤后大鼠神经源性膀胱，连续干预7 d后发现，大鼠脊髓组织凋亡率降低，膀胱顺应性增加，其作用机制可能与膀胱组织中促凋亡蛋白Cyt-C、caspase-3和caspase-9的表达下调有关，有助于重塑脊髓功能，提高盆底肌群的协调性。艾坤等[4]采用相同的针刺手法进行实验研究，发现电针次髎、中极、三阴交穴可直接抑制膀胱逼尿肌细胞中caspase-3蛋白的激活，提高逼尿肌收缩能力，舒张尿道外括约肌，对大鼠骶髓损伤后逼尿肌无反射型膀胱具有一定的保护作用。有研究发现，电针大椎、次髎、中极、三阴交等穴位可以降低骶部脊髓损伤大鼠膀胱组织中Apaf-1、Cyt-C和活化caspase-3、caspase-9蛋白的表达，促进脊髓功能恢复，调节膀胱及盆底神经支配，从而抑制逼尿肌反射亢进[3]。

1.2 细胞间信号通路

1.2.1 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)/酪氨酸受体激酶B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)信号通路BDNF是调控神经细胞发育、再生和存活的一种蛋白质，通常与其高亲和力TrkB结合，发挥促神经恢复的作用，脊髓损伤后膀胱组织的修复与髓内细胞中BDNF蛋白及基因表达的增加有关[5]。针灸可以促进细胞BDNF的表达与激活，影响丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)和cAMP等信号传导途径，抑制神经变性，改善神经元功能[6]。连续10 d电针(疏密波：疏波2 Hz，密波15 Hz，强度1 mA，20 min，每天1次) 关元穴、水道穴，可以提高脊髓损伤后尿潴留大鼠膀胱平滑肌兴奋性，其作用机制可能与上调BDNF与TrkB在脊髓组织中的表达有关，且电针关元穴的治疗效果明显优于电针水道穴[7]。

1.2.2 超极化激活环状核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gate cation channel，HCN)膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)可能是膀胱自身源性的兴奋性调节机制的枢纽，通过细胞间的各种离子通道或受体，将神经兴奋性信号传输至逼尿肌[8]。HCN在哺乳动物中有4种亚型(HCN1-4)，且仅在膀胱ICCs细胞中表达，其中HCN1通道是最重要的一种。研究发现，连续14 d电针(疏密波：密波20 Hz，疏波4 Hz，15 min，每天1次)次髎穴[9]，连续10 d电针(连续脉冲电流，频率2 Hz，强度0.5 mA，20 min，每天1次)中髎、中极、关元穴[10]，可以有效减少脊髓损伤后大鼠膀胱组织中ICC数量和HCN通道数量，降低膀胱逼尿肌中HCN mRNA及其蛋白质表达，改善大鼠膀胱逼尿肌的不稳定收缩频率和储存过程中逼尿肌的最大压力。

1.2.3 缝隙连接蛋白(connexin，Cx)Cx是细胞间兴奋传导通道，小鼠逼尿肌兴奋性改变和Cx43表达与脊髓损伤平面有关，骶上脊髓损伤小鼠逼尿肌反射亢进，Cx43表达升高，骶下脊髓损伤小鼠的状态则相反[11]。尿道上皮Cx43的表达与ATP释放存在同步昼夜节律，腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated proteinkinase，AMPK)是参与多种信号通路的关键蛋白，其活化机制主要是减少ATP消耗，维持细胞能量稳态，降低小鼠逼尿肌Cx43 mRNA及蛋白表达[12]。

1.2.4 平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)SMA是一种广泛存在于细胞的微丝蛋白，有α、β、γ三种形式，其中α-SMA主要分布于膀胱肌层，是肌细胞收缩装置的一部分。膀胱顺应性与逼尿肌收缩肌丝中α-SMA的表达密切相关，脊髓横断后，α-SMA表达的减少会降低逼尿肌收缩功能，使膀胱呈现无力、大容量的弛缓状态[13]。连续10 d电针(疏密波，疏波2 Hz，密波15 Hz，强度 1 mA，20 min，每天1次)关元穴，能有效增加脊髓损伤尿潴留大鼠逼尿肌中α-SMA的表达，降低逼尿肌最小张力，提高膀胱收缩频率及兴奋性[14]。Mitsui等[15]在探讨交感神经放松逼尿肌平滑肌及黏膜肌层的功能时发现，二者均表达出α-SMA免疫反应性，黏膜肌层是逼尿肌主要的收缩元件。

1.3 Wnt/β-catenin信号通路Wnt信号通路是由配体蛋白Wnt与七次跨膜蛋白受体Frizzled相结合而激发一系列下游信号蛋白转录的转导途径，共有Wnt/β-catenin通路、平面细胞极性Wnt/PCP通路、Wnt/Ca2+通路3条分支，其中研究最多、最经典的为Wnt/β-catenin 信号通路，它在整个生物进化过程中十分保守，主要活化机制为Wnt信号与Fzd受体结合，引发膜上辅助性受体被糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)磷酸化，与胞质内大蛋白复合物中的支架蛋白Axin结合，从而使β-catenin从复合物中解离，防止被泛素化，最终使活性因子β-catenin在胞内富集并转位到核内，与调控元件TCF结合，激活靶转录基因。Wnt/β-catenin信号通路被证实与针刺干预脊髓损伤后细胞凋亡、轴突引导、干细胞分化、神经元存活等有关[16]，该通路中 Wnt-1、β-catenin、GSK-3β等重要分子可能是治疗脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍的作用靶点，干预机制为诱导内源性神经干细胞 (endogenous neural stem cells，ENSCs)增殖分化为神经元，促进突触再生和神经修复[17]。

转录调控蛋白β-catenin是钙黏蛋白复合物的主要成分之一，其在胞质中的稳定性以及在核内的积累是这条信号通路的核心。研究发现，连续7 d电针(疏密波：疏波10 Hz，密波50 Hz，留针20 min，每天1次)大椎、次髎穴，可以提高大鼠脊髓组织中Wnt-1、β-catenin mRNA及Ngn1蛋白等的表达水平，显著改善T10脊髓横断后膀胱逼尿肌反射亢进大鼠的泌尿功能[18]。CyclinD1作为细胞周期调控中最重要的亚单位，与β-catenin的表达呈正相关，是该信号通路的下游靶基因，上述电针针法可以上调脊髓组织中CyclinD1 mRNA表达，促进脊髓内源性神经干细胞的增殖与活化[19]。

1.4 PI3K/AKT/mTOR信号通路PI3K是一种脂类激酶，可被多种细胞因子、生长因子和激素等信号激活，其中，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族中的关键成员，与其络氨酸蛋白激酶受体A(tyrosine kinase，TrKA)的结合与膀胱逼尿肌兴奋性密切相关，可以抑制脊髓损伤局部细胞自噬，重建膀胱功能[20]。研究发现，连续7 d针刺夹脊穴可以增加脊髓组织中NGF与TrKA的表达，促使PI3K/AKT信号通路磷酸化，下调脊髓组织中自噬标志蛋白LC3B表达，上调P-AKT、P-mTOR和自噬特异性底物P62表达，从而抑制脊髓损伤后神经元细胞的自噬，重塑脊髓神经功能，改善膀胱尿潴留症状[21]。研究发现，连续4周电针(直刺 4～5 mm，疏密波，2 Hz，20 min，每天1次，每周5次)第2骶后孔神经，可以使NGF及其受体TrkA增殖，激活下游PI3K/AKT通路，激活相关抗凋亡因子，改善膀胱神经支配[22]。

mTOR是PI3K/AKT信号通路下游的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活的mTOR可以有效减少神经组织损伤和继发性脊髓损伤[23]。mTOR有mTORC1和mTORC2两种功能复合物，其中mTORC1是细胞增殖、凋亡和自噬的主要调节剂，可以激活下游靶蛋白p70S6K与4EBP1，促使核糖体活化、多肽翻译、嘧啶合成及细胞骨架形成[24]。研究发现，连续28 d电针(深度5～7 mm，频率2 Hz，强度1 mA，20 min，每天1次)脊髓损伤后大鼠大椎穴、命门穴，可以上调脊髓组织中p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR和p-p70S6/p70S6比值，下调负调控因子PTEN和caspase-3表达水平，促进脊髓神经功能恢复[25]。此外，PI3K/AKT信号通路的激活也可以上调或下调关键细胞周期的相关基因转录和蛋白质水平，包括CyclinD1、CyclinE、Bcl-2、CDK2和CDK4等，共同发挥抗细胞凋亡作用[26]。

1.5 cAMP/PKA信号通路垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP)是1989年日本学者在绵羊下丘脑中发现的一种神经肽，有PACAP-38、PACAP-27两种生物活性。PACAP可以通过第二信使cAMP激活细胞质基质中的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，促使PKA的催化亚基C进入细胞核，磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和功能蛋白，调节靶基因转录，产生细胞效应和基因表达，维持生物体多种生理系统的平衡。PACAP根据目标组织中的受体亚型表达产生差异性下游效应，生物组织学证实了PACAP及其同源受体PAC1在下尿道组织中的特异性分布[27]。膀胱功能的恢复与cAMP/PKA信号通路的激活密切相关，可以抑制神经细胞凋亡，保护脊髓神经调控作用[28]。PKA还可以使肌球蛋白轻链激酶失活，影响其与Ca2+-钙调蛋白复合物的亲和力，使其对钙离子失敏，促使膀胱平滑肌细胞舒张[29]。

激活cAMP/PKA信号通路，调控膀胱逼尿肌内收缩元件磷酸化，是针刺重建脊髓损伤后神经源性膀胱功能的重要机制。研究表明，连续7 d电针(疏密波：疏波10 Hz，密波50 Hz，20 min，每天1次)次髎、中极、三阴交、大椎等穴，可以增加受损脊髓组织中PAC1R、PACAP-38蛋白表达[30]，促进膀胱逼尿肌内MLCK、MLCP的磷酸化[31]，降低骶上脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠逼尿肌的病理损害程度，促进平滑肌细胞舒张，降低膀胱内压。研究发现，连续 7 d 以毫针(0.25 mm×13.0 mm)针刺(斜入约 2 mm，20 min，每天1次)夹脊穴，配合低频电刺激，可以上调脊髓损伤后尿潴留模型大鼠脊髓和膀胱逼尿肌组织中PACAP蛋白表达，增加脊髓和逼尿肌组织内cAMP、PKA含量，促进脊髓神经修复，诱导逼尿肌舒张，改善膀胱功能[32]。

1.6 MAPK信号通路膀胱逼尿肌细胞收缩功能的改变与MAPK信号通路的激活密切相关[33]。MAPK信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、血管生成中发挥重要作用，主要包括ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38MAPK和ERK5共4条通路[34]。目前已发现，JNK和p38 MAPK通路主要与细胞凋亡和炎症反应有关，ERK/MAPK信号通路是研究最深入的MAPK信号通路，与细胞的增殖和分化密切相关[35]。

研究发现，连续15 d毫针针刺(进针约2 mm，留针15 min，每天1次)大椎、肾俞、足三里能明显抑制小鼠脊髓组织内p38MAPK信号通路的激活，下调脊髓组织中p-p38MAPK的蛋白含量，下调小鼠血清中IL-1β的蛋白表达，共同改善小鼠神经功能损伤症状[36]。电针夹脊穴能够抑制ERK5信号通路下游因子CREB、Bcl-2的表达与活化，抑制脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡[37]。激活ERK1/2信号通路可以调节脊髓施万细胞的增殖，有效修复脊髓损伤后大鼠神经功能，减少二次脊髓损伤[38]。

1.7 嘌呤能受体信号途径嘌呤递质主要有腺苷、ATP和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，嘌呤受体可分为P1和P2两大类，其中P2受体又可分为P2X(包含P2X1～P2X7 7个亚型)和P2Y(包含P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14 8个亚型)两大家族[39]。在家兔膀胱舒张时，膀胱上皮释放的ATP可以刺激尿道感觉神经，产生激活排尿反射的信号[40]，由此可知ATP可能是膀胱的传入信号，作用是使膀胱逼尿肌兴奋[41]。在人和大鼠的逼尿肌肌膜中均发现有P2X受体，逼尿肌中P2X2受体表达量的增加[42]和P2X3、P2X5等受体表达的缺失都会影响脊髓损伤后膀胱收缩功能[43]。

ATP作为一种非肾上腺素非胆碱能神经递质，在生物体内有广泛的受体介导作用，可以作用于膀胱P2X多种亚型受体，其中，作用于P2X3、P2X5受体对脊髓损伤后膀胱功能的恢复尤为重要[44]。研究发现，连续12 d隔姜灸(每个穴位灸10 min)关元、命门、足三里、阴陵泉等穴，可以提高脊髓损伤大鼠脊髓神经节嘌呤能P2X3受体表达，从而改善膀胱功能[45]。连续14 d电针关元、次髎穴，可以提高脊髓损伤后大鼠逼尿肌ICC数量及表面受体P2X5的阳性表达率，改善逼尿肌的收缩功能[46]。此外，大鼠膀胱逼尿肌上的P2Y2、P2Y4受体表达与脊髓损伤节段有关，P2Y2、P2Y4表达增高可能是引起逼尿肌反射亢进的机制之一[47]。

2 小结与展望

各信号通路之间不是简单的直线型结构，而是网状调节模式，存在许多复杂的串扰效应，即一条信号转导通路的激活信号分子可以调节另一条信号转导通路中的信号分子，而激活的信号分子就是产生串扰效应的关键目标，也是实验研究的重要靶目标。针刺干预脊髓损伤后神经源性膀胱信号通路的相关研究已成为当下的研究热点，今后需关注以下方面：目前实验研究多集中于单一信号分子或通路层面上，各通路之间的交互作用有待进一步证实；针刺穴位、干预方法及参数选择缺乏统一标准，难以分析疗效间关系，且针刺疗效一般持续7 d，时间较短，且缺乏远期随访；针刺通过干预MAPK信号通路、抑制脊髓组织细胞凋亡，从而提高膀胱逼尿肌细胞收缩功能，这一机制需要更多的临床试验来证实；目前已证实针刺可以激活cAMP/PKA信号通路，火针夹脊穴可以双向调节Wnt/ERK多信号通路，进而干预脊髓损伤后膀胱功能的恢复[48]，但研究尚缺乏对这些通路上下游信号分子及其他相关转录蛋白的基因表达检测，且尚无研究证实针刺改善脊髓损伤后膀胱收缩功能与这些信号通路间的直接关系；转化生长因子TGF-β1与Smad3蛋白信号可能通过影响Cx43表达影响排尿功能[49]，这些蛋白信号分子为针刺干预脊髓损伤后膀胱逼尿肌功能研究提供了新的思路；现有研究已证实嘌呤能信号与脊髓损伤后神经源性膀胱运动与感觉功能有关，而五羟色胺、血管活性肠肽、降钙素基因相关肽、P物质等亦可能是其重要分子机制，有望为今后临床研究提供新的干预靶点[50]。