microRNA调控脓毒症中性粒细胞胞外诱捕网的研究进展

陈聪敏, 丁新耘， 马 源， 张晓慧, 马玉清

中性粒细胞是重要的固有免疫细胞，机体发生感染时最先到达炎症部位，释放大量炎症因子并吞噬病原体。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)是指活化的中性粒细胞向胞外排出经抗菌蛋白修饰的染色质[1]。脓毒症时持续大量的炎症介质触发NETs不受控制释放、捕获和杀死病原体的同时，导致组织器官损害(如低血压、低氧血症、凝血障碍、肾脏、肝脏和神经功能障碍[2])。NETs的产生途径已逐渐清晰，但NETs的调控机制目前尚不明确。

microRNA(miRNA)是普遍存在于真核细胞中的非编码RNA，参与细胞的生理过程和疾病的发生、发展，包括脓毒症时NETs的产生。近年来有研究[3-5]发现，miR-3146诱导NETs产生，可以加重痛风发作；miR-144激活NETs，加重输血相关急性肺损伤；miR-146a、miR-155、miR-378a-3p和miR-15b-5p可调节NETs的形成以及脓毒症相关器官损伤。因此，需要明确miRNA调控脓毒症NETs介导脏器损伤的具体机制，以期为脓毒症靶向治疗提供有效策略。

1 miRNA 的生物合成与功能

miRNA是一类由内源基因编码的单链RNA分子，长度约为18～24个核苷酸，在转录后基因表达中发挥作用。miRNA的生物合成始于RNA聚合酶Ⅱ的基因转录，其转录产物miRNA前体(pri-miRNA)被Drosha-DGCR8复合物剪切成具有发卡样结构的pre-miRNA[6]。通过Exportin-5蛋白出核后，pre-miRNA被Dicer酶切割成双链miRNA。成熟的miRNA功能链与AGO2蛋白一起组装到miRNA诱导的沉默复合物(RISC)中[6]。RISC中的miRNA与其靶信使核糖核酸(mRNA)的3′端非翻译区(3′-UTR)碱基配对，抑制其翻译或者降解mRNA；然而在某些条件下(如细胞应激、血清饥饿)，miRNA促进mRNA的表达[7]。miRNA调控人类30%左右的基因表达，参与细胞的分化、生长、增殖、黏附、迁移和凋亡等生理过程，同时参与许多疾病的发生、发展[8-10]。

2 NETs的发现

2004年Brinkmann等[1]发现在佛波酯的刺激下，活化的炎性中性粒细胞向胞外释放由组蛋白、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)等抗菌蛋白修饰的脱氧核糖核酸(DNA)网状结构，即NETs。

中性粒细胞形成NETs的过程被称为NETosis，主要包括三种途径：①自杀式NETosis[11]。此经典途径大约需要2～3 h，通过中性粒细胞的死亡形成。被佛波酯、病原体、炎症因子等刺激后，中性粒细胞通过蛋白激酶C(PKC)/纤维肉瘤蛋白(Raf)/丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，产生大量活性氧(reactive oxygen specie，ROS)，激活自噬。核酶肽酰精氨酸脱亚氨酶4(peptidylarginine dei-minase4，PAD4)将组蛋白H3修饰为瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3),导致染色质解聚；同时MPO和NE移位核内，协同染色质解聚，核膜破裂，网状结构进入胞质，网罗抗菌蛋白，最后被释放到胞外，消灭病原体[12]。②存活式NETosis[13]。不依赖ROS的途径且仅需要数分钟。由Toll样受体和补体C3介导NETs的产生，并以囊泡释放胞外，此时无核的中性粒细胞仍具备吞噬功能，与自杀式NETosis相比，此途径的NETs对核酸酶更耐受，且能有效根除病原体。③来源于线粒体DNA的存活式NETosis，也依赖ROS的产生[14]。

3 脓毒症中NETs的两面性

脓毒症时中性粒细胞释放的NETs是一把双刃剑，消灭病原体的同时也遭受NETs相关组织损伤和器官衰竭。有研究[15]表明，NETs及其组分与脓毒症严重程度及预后密切相关，推荐其作为脓毒症诊治的新型生物标志物。

3.1脓毒症中NETs的防御功能 脓毒症指因宿主对感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[16]。目前全球脓毒症患者已达4900万人，其死亡人数占全世界死亡人口的20%。感染早期NETs的产生对消除病原微生物至关重要。DNA是NETs发挥抗菌活性的结构基础。Clark等[17]发现，经脂多糖(LPS)刺激的血小板和中性粒细胞共同培养后，NETs大量生成，并具有捕获大肠杆菌的能力，使用DNA酶降解后，细菌捕获能力明显减弱。脓毒症时入侵的病原微生物被固定于网状纤维骨架中防止扩散，DNA酶破坏其结构完整性后，细菌从NETs中释放，加重疾病进展。组蛋白是NETs中含量最丰富、杀菌活性最强的成分，病原体被DNA纤维骨架物理遏制后，局部高浓度组蛋白开始发挥杀菌作用。研究[1]发现，组蛋白可在30 min内杀死福氏链球菌、鼠伤寒链球菌和金黄色葡萄球菌，使用组蛋白抗体后，可消除NETs的杀菌作用。富含精氨酸的组蛋白H4在细胞膜表面形成泡状结构和孔隙，破坏细菌膜结构；富含赖氨酸的组蛋白H2B通过脂磷壁酸与金黄色葡萄球菌结合，破坏细胞结构完整性，二者可通过不同机制清除病原微生物[18]。NETs的组分NE也具有抗菌活性，其通过降解大肠杆菌细胞壁的外膜蛋白A，破坏细菌完整性。在脓毒症模型中，NE基因缺陷型小鼠较野生型小鼠清除大肠杆菌的能力降低，病死率升高[19]。抗菌蛋白MPO可将过氧化氢和氯化物转化为次氯酸，渗透入菌体内，与细菌蛋白、酶等发生氧化反应，干扰糖代谢，导致细菌死亡。MPO 缺乏症患者对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌等病原微生物的杀伤力减弱，细菌感染明显增加，诱发或加重炎症性疾病[20]。

3.2脓毒症中NETs的损伤作用 NETs抗菌的同时也介导组织器官的损伤。脓毒症时异常数量的NETs不能被DNA酶充分降解，导致毛细血管阻塞、微循环受损、炎症反应加强以及组织器官损伤。如游离DNA(cell free DNA，cfDNA)不仅损伤纤溶过程，而且通过与红细胞、血小板、纤维蛋白和凝血因子的结合，强化血栓超微结构[21]；NETs以剂量依赖的方式介导肺泡上皮细胞和内皮细胞死亡，使用组蛋白抗体可以降低NETs介导的细胞毒性作用，表明产生细胞毒性的主要成分是组蛋白[22]。Denning等[23]认为，NETs及其组分cfDNA、组蛋白、MPO属于损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)，可进一步激活免疫细胞，扩大炎症级联反应，导致脓毒症相关器官功能损伤。

4 miRNA对脓毒症时NETosis的调节

大多数免疫细胞的研究都涉及miRNA在巨噬细胞和淋巴细胞中的调节作用，但关于miRNA调节中性粒细胞的信息依然有限。NETosis机制目前尚未完全阐明，但有三个关键步骤，即ROS产生、PAD4介导的染色质解聚、自噬激活；miRNA为脓毒症时NETosis的有效调控因子，主要靶向通过以下三个过程发挥作用。

4.1miR-146a通过ROS调控NETs

ROS是触发NETosis的分子开关，能够促进PAD4诱导的染色质解聚，介导NE和MPO入核，激活自噬，维持自身高水平状态等。在脓毒症小鼠模型中，使用ROS有效清除剂丙酮酸乙酯，可减轻NETs介导的肠屏障功能障碍[24]。因此ROS对NETs的形成至关重要。

有研究发现，miR-146a通过ROS调控NETs的生成。Arroyo等[25]研究发现，脓毒症患者血清中miR-146a水平降低并伴有NETs增多。miR-146a基因缺陷的脓毒症小鼠体内ROS水平明显升高，介导中性粒细胞释放大量NETs，进一步引起肺泡上皮损伤和微循环内皮细胞损伤[26]。miR-146a调控ROS的具体机制与Toll样受体4(TLR4)/内向整流钾通道(IRK1)/肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)/核转录因子(NF)-κB信号通路相关。miR-146a可直接靶向TLR4 mRNA、IRK1 mRNA和TRAF6 mRNA的3′-UTR，使其翻译受阻，降低下游NF-κB活性，减少炎症因子释放[27-28]。有学者[26]证实，miR-146a基因缺陷的中性粒细胞表面TLR4高表达，NF-κB活性增强，产生更高水平的炎症介质。细胞内促炎因子水平与细胞衰老程度呈正相关，老化的中性粒细胞会过度产生ROS[29]。因此，当miR-146a基因缺陷，使得TLR4/IRK1/TRAF6/NF-κB信号通路活性增加，中性粒细胞处于高炎症水平，导致老化型中性粒细胞占比明显增加，ROS大量产生，诱导NETosis。

4.2miR-155通过PAD4调控NETs

人体内存在五种PAD4酶，其中核酶PAD4高度表达于中性粒细胞。NETs形成过程中PAD4以钙依赖的方式催化组蛋白H3的精氨酸转化为瓜氨酸，导致染色质正电荷丢失，组蛋白与DNA的结合力减弱，染色质解聚，使用PAD4抑制剂BMS-P5可阻断NETosis，并延缓疾病进展[30]。因此，PAD4酶在NETosis中极为重要。在LPS诱导的脓毒性休克模型中，PAD4基因敲除小鼠的NETosis受到抑制，肠道炎症水平减轻，肠屏障损伤得到明显改善[31]；同时体外实验发现，NETs以剂量依赖性的方式损伤结直肠癌细胞(Caco-2)上皮屏障。

Hawez等[32]发现，佛波酯刺激miR-155模拟物转染的中性粒细胞，PAD4 mRNA表达上调，且DNA-组蛋白复合物含量增加；Avin等[33]在脓毒症模型中验证了这一观点，miR-155基因敲除小鼠PDA4和NETs降低，中性粒细胞浸润减少，脓毒症肺损伤程度减轻。PAD4是miR-155的直接靶点，miR-155通过靶向PAD4 3′-UTR区域一段互补的AU序列，明显提高PAD4 mRNA水平，减弱脓毒症小鼠NETs相关的脏器损害[32]。真正评估miR-155的作用还需临床试验，研究脓毒症病理条件下rs767649对于NETosis的影响[34]。Chen等[35]提出，miR-3164靶向PAD4 mRNA的3′-UTR，下调PAD4 mRNA，PAD4翻译抑制后，CitH3产生减少，在脓毒症病理生理条件下，miR-3164是否靶向PAD4，仍需进一步研究。

4.3miR-15b-5p和miR-378a-3p通过自噬调节NETs

自噬是以双层膜结构的自噬体为标志，融合溶酶体后降解细胞器、蛋白质等成分，实现物质的循环利用，维持真核细胞内稳态。自噬维持高水平的ROS，导致NETs持续释放，抑制自噬后染色质解聚、细胞凋亡活动受阻[36]。脓毒症患者体内NETs生成增加伴随自噬水平升高，死亡患者NETs生成减少且自噬受损[37]。由此可见，自噬与脓毒症NETosis密切相关。

miRNA参与自噬相关蛋白和信号通路的调控。Jiao等[38]发现，脓毒症小鼠血清中NETs浓度与富含miR-15b-5p和miR-378a-3p的外泌体呈正相关。将预处理的中性粒细胞与LPS刺激的血小板源性外泌体共同培养时发现，3-甲基腺嘌呤抑制NETs形成，雷帕霉素进一步促进NETs形成。由此可见，miR-15b-5p和miR-378a-3p通过调控自噬，调控NETs生成。蛋白激酶B(Akt)/哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是经典的自噬负调节途径，磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)是一种Akt激活剂，通过Thr-308磷酸化激活Akt。研究[39]发现，PDK1的3′-UTR包含miR-378a-3p的一段互补序列；Li等[40]也证明，人类、小鼠和犬类的PDK1均包含miR-378a-3p的结合靶点。因此，PDK1是miR-378a-3p的直接靶点。在转染miR-15b-5p和miR-378a-3p模拟物的HL-60细胞中，PDK1、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)水平下调，微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3BⅡ)蛋白水平上调，细胞上清液中双链DNA(dsDNA)浓度增加[38]。miR-15b-5p和miR-378a-3p通过靶向PDK1调节Akt/mTOR自噬途径，诱导NETs形成，还可以作用于自噬激活剂高迁移率族蛋白B(HMGB)来诱导NETs形成。

5 总结和展望

脓毒症发病机制复杂，尚无有效的诊断治疗方法，预后很大程度上取决于早期识别和干预。而NETs成分MPO-DNA含量与脓毒症序贯器官衰竭评分(SOFA)呈正相关，降解或减少脓毒症NETs生成将成为研究热点。Paula等[41]发现，早期且同时使用DNA酶和抗菌药物治疗，可以提高脓毒症小鼠生存率，并减少重要脏器功能障碍的发生。因此，液体疗法、抗菌药物和NETs靶向药物的联合治疗，可以优化脓毒症患者的治疗效果，具有一定临床应用价值。

miRNA作为脓毒症NETosis的有效调控因子，同时参与相关炎症、自噬、凋亡等调控途径。如果能通过靶向miRNA进而调控NETs生成减少，减轻脓毒症患者器官功能损害，提高存活率且改善预后，将会为脓毒症的治疗提供新方向。目前已发现，抑制miR-155可减少NETs介导的脓毒症相关肺损伤，miR-1696、miR-16-5p等也参与NETs的调节，但是否调控脓毒症病理条件下NETs生成及其具体机制，仍需要进一步研究和验证。