血浆线粒体DNA水平与脓毒症患儿病情严重程度及预后的相关性

邵贤丽, 王倩云, 刘国文, 赵华锋, 方 育

(1.潍坊医学院，山东 潍坊 261041 2.山东省潍坊市人民医院儿科，山东 潍坊 261041 3.昆明医科大学第一附属医院麻醉科, 云南 昆明 650032)

脓毒症是临床常见的危重症，是儿童重症监护室(ICU)面临的棘手难题，病因是由于颅内、肺部等器官组织感染而导致宿主反应失调，并引起的全身炎症反应综合征，可导致一个或多个器官功能障碍，易进展为脓毒性体克，是ICU患儿死亡的主要原因[1,2]。且从长期随访调查显示，在其后的岁月中部分存活患儿的认知及身体都可能受到不同程度的影响。因此，救治脓毒症患儿一直都是ICU医务工作者的巨大挑战，备受重视。进入二十一世纪后，虽然医疗科技飞速发展，但小儿脓毒症的发病率和死亡率仍居高不下，特别是严重脓毒症患儿的救治十分困难。因此小儿脓毒症的早期诊断，及时评估病情严重程度及预后，对指导治疗、提高存活率至关重要。但目前临床常用的降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸(Lac)等生物标记物及小儿危重病例评分法(PCIS)等评分系统仍难以满足脓毒症患儿早期诊断、危险分层及预后评估的需求，仍需不断探索新的有价值的生物标记物以提高诊断和评估的准确性。血浆游离DNA是细胞坏死、凋亡释放的游离DNA片段，其中可检测到的主要有线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mt-DNA)、核DNA (Nuclear DNA,n-DNA)[3]。有研究发现，脓毒症的发生和发展与线粒体损伤密切相关[4]，而mt-DNA 较之n-DNA因结构简单、长度短、拷贝数高受到的关注度更高。目前已有研究显示，在成人脓毒症患者中mt-DNA异常升高，且在脓毒症的危险分层及预后评估中敏感度和特异度性和灵敏性优于PCT,CRP等生物标记物，对成人脓毒症死亡有较高的预测价值[5]。但国内将其用于脓毒症患儿危险分层及预后评估的研究较少。为此，本研究对mt-DNA水平与脓毒症患儿病情严重程度及预后的相关性进行分析，旨在寻找更多的脓毒症患儿危险分层及预测预后的生物标志物，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:我院2021年1月至2022年3月儿童重症监护室(ICU)脓毒症患儿103例作为研究对象，根据严重程度分为普通脓毒症组57例，严重脓毒症组46例；同期性别、年龄匹配的ICU感染患儿50例设为感染组，同期性别、年龄匹配的健康儿童作为对照组，各组儿童平均年龄、性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。各组平均体温、器官功能障碍数、感染部位构成差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较，感染组、脓毒症组、重度脓毒症组患儿平均体温、感染部位构成差异无统计学意义(P>0.05)。感染组、脓毒症组、重度脓毒症组患儿器官功能障碍数差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组患者基线资料比较

1.2纳入及排除标准:经院医学伦理委员会批准。纳入标准：①具有完整的病历及辅助诊断资料；②年龄<14周岁；③符合国际儿科脓毒症会议2012年脓毒症诊断标准[6]，患儿家长知情同意研究方法，签署知情同意书。排除标准：①合并血液系统疾病、肝肾疾病、内分泌系统疾病等患儿；②先天性代谢性疾病、先天性心脏病患儿。

1.3方 法

1.3.1研究方法：根据脓毒症严重程度分为普通脓毒症组57例，严重脓毒症组46例，同期性别、年龄匹配的ICU感染患儿50例设为感染组，比较各组mt-DNA、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、乳酸(Lac)水平；采用Spearman双变量分析mt-DNA与PCT、CRP、Lac水平及严重程度、器官功能障碍、死亡风险的相关性。根据患儿入院后28d转归情况，分为存活组和死亡组，比较两组血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平，建立ROC曲线，分析血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac对脓毒症患儿预后的预测价值。

1.3.2检测方法：脓毒症与重度感染患儿均于入ICU 24h采集外周血，于室温下静置30min离心取上层血浆。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测mt-DNA，为了保证检测结果的一致性，所有样品均使用同一批次的微量柱离心式 QIAamp DNA blood Mini抽提试剂盒。采用胶体金法检测PCT、CRP、Lac水平，试剂盒购自上海奥普生物医药有限公司。

1.3.3相关量表测评：采用小儿危重病例评分法(PCIS)评价病情严重程度，评分越低，病情越危重；采用第2代小儿器官功能障碍评分(PELOD-2)评价器官功能障碍，评分越高，病情越危重；采用第三代小儿死亡风险评分(PRISMⅢ)评价死亡风险，评分越高，死亡的风险越高。

2 结 果

2.1各组mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比较:各组mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间mt-DNA水平两两比较：重度脓毒症组高于脓毒症组、感染组、对照组；脓毒症组高于感染组、对照组；感染组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间PCT、CRP、Lac水平两两比较：重度脓毒症组高于脓毒症组、感染组、对照组；脓毒症组、感染组高于对照组，脓毒症组Lac水平高于感染组，差异均有统计学意义(P<0.05)。脓毒症组与感染组PCT、CRP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组mt-DNA PCT CRP Lac水平比较

2.2不同严重程度脓毒症患儿PCIS、PELOD-2、PRISMIII评分:重度脓毒症组患儿PCIS评分低于脓毒症组，PELOD-2、PRISMIII评分高于脓毒症组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

图1 血浆mt-DNA与PCT的相关性

2.3相关性分析:血浆mt-DNA与 PCT、CRP、Lac及PELOD-2、PRISMⅢ评分呈正相关(r=0.877、0.904、0.875、0.923、0.870，P均=0.000)。血浆mt-DNA与PCIS评分呈负相关(r=-0.841，P=0.000)。详见表4、图1～6。

表3 两组脓毒症患儿PCIS PELOD-2 PRISMIII

表4 血浆mt-DNA与 PCT CRP Lac及PCIS PELOD-2

2.4不同预后脓毒症患儿mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比较:死亡组患儿血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平均高于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 脓毒症生存组和死亡组患儿mt-DNA PCT CRP Lac水平比较

图2 血浆mt-DNA与CRP的相关性

图3 血浆mt-DNA与Lac的相关性

图4 血浆mt-DNA与PCIS评分的相关性

图5 血浆mt-DNA与PELOD-2评分的相关性

图6 血浆mt-DNA与PRISMⅢ评分的相关性

2.5预测价值:建立ROC曲线，血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平的Cut-off为1124.28pg/mL、18.49ng/mL、27.38mg/L、3.04mmoL/L时，Youden最高，AUC分别为0.817、0.716、0.607、0.759。血浆mt-DNA预测脓毒症预后的敏感度为80.95%，明显高于PCT、CRP、Lac的71.43%、66.67%、76.19%；血浆mt-DNA预测脓毒症预后的特异度为93.90%，明显高于PCT、CRP、Lac的81.71%、75.61%、74.39%，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表6、图7。

表6 血浆mt-DNA PCT CRP Lac对脓毒症预后的预测价值

图7 血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac预测脓毒症患儿预后ROC曲线

3 讨 论

目前国内外文献报道的与脓毒症诊断、危险分层、监控等相关的生物标记物多达上百种，而PCT、CRP、Lac等是临床最常用的生物标志物[7]。但上述指标仍有一定的局限性。PCIS等评分系统在脓毒症患儿的危险分层及预后判断中有着一定的价值，但这些量表项目繁多，操作复杂，而且有一定的主观性，限制了在临床的应用。所以目前仍缺乏有价值的生物标志物以提高预测脓毒症患儿病情严重程度及预后准确性的生物标记物。研究发现[8]，在脓毒症状态下，大量细胞遭到破坏及凋亡，细胞中的线粒体受到损害后，大量线粒体DNA释放到细胞质中，致先天免疫反应及不同识别的模式受体被激活，引起强烈的氧化应激和免疫反应，致细胞能量产生不足，继而出现代谢紊乱，免疫和器官细胞凋亡，最终导致一个或多个器官功能衰竭甚至死亡。有研究结果[9]显示，重度脓毒症患者血浆mt-DNA水平高于全身炎症反应综合症，差异有统计学意义。本研究结果显示，重度脓毒症组和脓毒症组血浆mt-DNA水平高于感染组和对照组；重度脓毒症组血浆mt-DNA水平高于脓毒症，差异均有统计学意义。相关性分析结果显示，血浆mt-DNA与PCT、CRP、Lac及PELOD-2、PRISMⅢ评分呈正相关，与PCIS评分呈负相关。提示感染及脓毒症患儿血浆mt-DNA水平均会异常升高，且血浆mt-DNA水平与病情严重程度、脏器损伤程度、预后均呈线性相关。与Satoshi研究结果基本一致，提示血浆mt-DNA可作为脓毒症患儿病情严重程度评估有价值的客观指标。脓毒症易合并多器官功能障碍，随着病情的进展，发生脓毒症体克直至死亡[10]。血浆mt-DNA可在一定程度上反应病情严重程度及器官功能障碍，由此推测其可能在脓毒症预后的评估中有较高的临床价值。在成人脓毒症的研究中[11]，血浆mt-DNA预测成人脓毒症患者死亡中敏感度优于CRP、PCT、Lac。本研究结果显示，虽然死亡组患儿血浆mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平均高于存活组，但血浆mt-DNA预测脓毒症预后的敏感度和特异度明显高于PCT、CRP、Lac，差异有统计学意义，说明血浆mt-DNA对脓毒症患儿预后的预测价值较高。mt-DNA存在于所有的器官组织细胞中，一旦出现全身炎症反应或器官组织损伤，受损的器官组织中必然会释放mt-DNA，且mt-DNA释放量与全身炎症反应或器官组织损伤程度成线性相关，检测mt-DNA水平不仅可反应脓毒症患儿全身炎症反应，还可反应器官的累积损伤程度。另外当脓毒症发生后，一方面随着病情的加重，凋亡的细胞逐渐增多，线粒体受损，细胞中mt-DNA释放入血增加。另一方面清除mt-DNA的器官可能出现功能障碍，致mt-DNA不能及时被清除，导致血浆mt-DNA水平升高。

综上所述，本研究结果显示，血浆mt-DNA可作为脓毒症患儿病情严重程度及预后判断的潜力的生物标志物，且与PCT、CRP、Lac相关，且在预后的预测价值高于PCT、CRP、Lac。本研究的不足在于为单中心研究，结果可能存在偏倚。