结直肠癌组织中lncRNA TUSC7与miR-1270表达的相关性及临床病理意义

姜 辉，任维聃，刘桂伟，冶浩鹏，郭庆金，耿学辰，姜国胜

(1.河北省沧州市人民医院肛肠外科，河北 沧州 061000 2.河北省沧州市中心医院结直肠肛门外科，河北 沧州 061000)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种多发于40岁以上中老年人的癌症，由于饮食及生活习惯的改变，其发生率逐年上升[1]。因此，寻找与CRC相关，且可评估CRC患者预后的标志物尤为关键。微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)均是不能编码蛋白的RNA分子，两者均可能参与CRC发生发展[2,3]。近期报道显示，lncRNA肿瘤抑制候选基因7(lncRNA tumor suppressor candidate 7,lncRNA TUSC7)在CRC中呈低表达，与CRC患者预后密切相关[4]；微小RNA-1270(microRNA-1270,miR-1270)在胃癌中表达上调，高表达miR-1270与患者不良预后相关，miR-1270可能是诊治胃癌的潜在靶标[5]。基于上述研究，本文检测了miR-1270在CRC组织中的表达情况，分析其与lncRNA TUSC7、CRC预后关系，为临床诊治CRC提供新参考。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年6月至2019年1月本院诊治的CRC患者130例进行研究，年龄42～70岁，平均年龄(58.07±10.66)岁，<60岁67例，≥60岁63例；低分化45例，中、高分化85例；男71例，女59例；浸润深度：T1～T2 78例，T3～T4 52例；病理类型：浸润型15例，隆起型26例，溃疡型89例；淋巴结转移48例，淋巴结未转移82例；肿瘤直径：< 5cm 61例，≥5cm 69例；TNM分期：Ⅲ～Ⅳ期54例，Ⅰ～Ⅱ期76例。本院伦理委员会批准本研究，受试者和家属对此研究知情同意。CRC患者纳入标准：①符合CRC诊断标准[6]，经病理诊断为原发性CRC；②患者病例及检查资料齐全；③入院前未行放化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗；④除CRC外，不伴有其他原发性肿瘤。排除标准：①随访资料缺失、病理类型难以判定者；②合并严重脏器病变者。

1.2方 法

1.2.1lnCAR数据库检索:采用lnCAR数据库(https://lncar.renlab.org/#1st-screen)检索CRC和正常结直肠组织中lncRNA TUSC7表达情况。

1.2.2标本收集:收集130例CRC患者行根治性手术切除的CRC组织、癌旁组织(距肿瘤边缘≥5 cm)，生理盐水清洗，立即放入液氮罐(冻存24h)，移至-80℃冰箱。

1.2.3实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平:取出-80℃冰箱储存的CRC和癌旁组织，无菌条件下，研钵中研碎，添加Trizol Reagent(简石生物技术有限公司，CT2001)以提取CRC和癌旁组织中的总RNA；使用MultiMACS(TM) cDNA Synthesis Kit(美国Miltenyi公司，130-094-410)将总RNA反转录成cDNA；最终，应用SYBR Green qPCR Master Mix(美国MCE公司，HY-K0501)、qRT-PCR仪(美国ABI公司，PRISM®7900HT)扩增cDNA，读取各基因循环阈值(CT值)。扩增参数：98.4℃预变性8min；97.6℃变性15s，64.5℃退火10s，68.2℃延伸15s，40个循环。GAPDH、U6分别是lncRNA TUSC7、miR-1270的内参基因(引物序列见表1)。lncRNA TUSC7、miR-1270相对表达量以2-△△CT法计算。

表1 lncRNA TUSC7 GAPDH miR-1270 U6引物序列

1.2.4生物信息学网站预测lncRNA TUSC7与miR-1270的关系:使用生物信息学网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测lncRNA TUSC7与miR-1270间的关系。

1.3随访:以电话、入户等方式跟踪随访CRC患者6～36个月，以CRC患者手术后次日作为随访起点，随访截至CRC患者死亡或2022年1月。

2 结 果

2.1lnCAR数据库中CRC组织与正常结直肠组织lncRNA TUSC7表达水平比较:lnCAR数据库分析显示，CRC组织lncRNA TUSC7表达水平较正常结直肠组织降低(P<0.05)。见图1。

图1 lnCAR数据库中CRC和正常结直肠组织中lncRNA TUSC7表达水平比较

2.2癌旁和CRC组织中lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平比较:CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平较癌旁组织降低(P<0.05)，miR-1270表达水平较癌旁组织升高(P<0.05)。见表2。

表2 癌旁/CRC组织中lncRNA TUSC7 miR-1270表达水平比较

2.3CRC组织lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平与临床病理特征的关系:以CRC组织lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平的中位数(0.39、2.67)为界值，以低于lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平中位数的CRC患者为lncRNA TUSC7低表达组(66例)、miR-1270低表达组(62例)，以高于或等于lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平中位数的CRC患者为lncRNA TUSC7高表达组(64例)、miR-1270高表达组(68例)。结果显示，CRC组织lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平与年龄、病理类型、性别、肿瘤直径无关(P>0.05)，与肿瘤淋巴结转移、浸润深度、分化程度、TNM分期相关(P<0.05)。见表3。

表3 CRC组织lncRNA TUSC7 miR-1270表达水平与临床病理特征关系n(%)

2.4CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平与miR-1270的相关性:Pearson法分析显示，CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平与miR-1270呈负相关(r=-0.578，P<0.05)，见图2；生物信息学分析显示，lncRNA TUSC7与miR-1270存在靶向结合位点，见图3。

2.5CRC组织lncRNA TUSC7、miR-1270表达水平与CRC患者预后的关系:跟踪随访CRC患者6～36个月，死亡45例，生存85例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，lncRNA TUSC7低表达组平均生存时间为27.77个月(95%CI：25.53～30.02)，短于lncRNA TUSC7高表达组平均生存时间34.34个月(95%CI：23.10～35.59)，log-rank检验结果显示，lncRNA TUSC7低表达组、lncRNA TUSC7高表达组累积生存率比较，差异有统计学意义(χ2=30.459，P=0.000)，见图4；miR-1270低表达组平均生存时间为33.90个月(95%CI：32.54～35.27)，长于miR-1270高表达组平均生存时间28.37个月(95%CI：26.15～30.58)，log-rank检验结果显示，miR-1270低表达组与miR-1270高表达组累积生存率相比，差异有统计学意义(χ2=18.172，P=0.000)，见图5。

图2 CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平与miR-1270的相关性

图3 生物信息学分析lncRNA TUSC7与miR-1270的靶向结合位点

图4 CRC组织lncRNA TUSC7表达水平与CRC患者预后的关系

图5 CRC组织miR-1270表达水平与CRC患者预后的关系

3 讨 论

CRC患者可出现便血、大便性状变化、腹痛等症状，临床多以手术治疗CRC为主，但治疗效果不容乐观，CRC患者预后较差[7]。因此，寻找与CRC有关的生物学靶点，对及时有针对性干预，提高CRC患者治愈率，降低病死率有积极意义。

lncRNA作为一类非编码RNA，其虽不可编码蛋白，但可调控信号转导，影响CRC等癌症细胞增殖、凋亡，参与机体免疫逃逸等过程[8]。研究发现，lncRNA TUSC7在食管鳞癌中表达下调，与淋巴结转移相关，lncRNA TUSC7有望成为诊治食管鳞癌的分子靶标[9]；另外，Zhang等[10]研究发现，过表达lncRNA TUSC7可抑制CRC细胞增殖、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，lncRNA TUSC7在CRC发展中起抑癌作用。本研究显示，CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平较低，与lnCAR数据库检索结果及曹珊珊等[4]研究趋势一致，提示lncRNA TUSC7可能与CRC病理发展相关。本文中CRC组织lncRNA TUSC7表达水平与肿瘤淋巴结转移、浸润深度、分化程度、TNM分期相关，提示lncRNA TUSC7可能与CRC严重程度有关，检测CRC组织lncRNA TUSC7表达水平有助于临床判断CRC患者病情，对制定针对CRC患者的干预方案甚是有利。进一步研究发现，lncRNA TUSC7低表达组CRC患者平均生存时间、累积生存率短于、低于lncRNA TUSC7高表达组，提示lncRNA TUSC7可能与CRC患者预后密切相关，lncRNA TUSC7表达水平越低，CRC患者预后越差，lncRNA TUSC7可辅助临床判定CRC患者预后情况。分析可能原因，lncRNA TUSC7可能通过与靶基因结合进而影响CRC细胞EMT、增殖、侵袭，从而影响CRC发展进程，显示出其与CRC患者TNM分期等临床特征、预后相关[10]。

miRNA是一类短链非编码RNA，其可参与肝细胞癌、CRC等癌细胞异常增殖，调节信号转导，介导自噬，影响肝细胞癌、CRC等疾病发生发展[11]。近期报道显示，miR-1270在食管癌、肝细胞癌中表达上调，且miR-1270可能是诊治食管癌、肝细胞癌的潜在靶标[12,13]。而miR-1270在甲状腺乳头状癌、膀胱癌中呈高表达，miR-1270在甲状腺乳头状癌、膀胱癌中发挥促癌作用[14,15]。以上研究表明，miR-1270在不同肿瘤中的作用不同。本文中CRC组织miR-1270表达水平较高，与其在胃癌中的趋势相同，提示miR-1270可能参与CRC发生发展，miR-1270可能是诊治CRC的分子靶点。进一步研究显示，处于Ⅲ～Ⅳ期、T3～T4浸润深度、低分化，发生淋巴结转移的CRC患者中miR-1270高表达患者占比较高，表明miR-1270可能与CRC发展程度相关，miR-1270有望成为评估CRC严重程度的标志物。另外，本研究显示，miR-1270低表达组CRC患者平均生存期、累积生存率长于高于miR-1270高表达组，表示CRC组织中miR-1270表达水平越高，CRC患者发生不良预后风险越大，miR-1270有望成为临床评估CRC患者预后的潜在指标。推测，miR-1270可能通过促进CRC细胞增殖、EMT，抑制CRC细胞凋亡，进而在CRC发生发展中起促进作用，从而显示出miR-1270与CRC患者TNM分期等临床特征、预后关系紧密[5]。

此外，生物信息学分析显示，lncRNA TUSC7与miR-1270存在靶向结合位点，故本文探讨了CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平与miR-1270相关性，结果显示，lncRNA TUSC7表达水平与miR-1270呈负相关，提示lncRNA TUSC7可能与miR-1270共同影响CRC病理变化，推测lncRNA TUSC7可能与miR-1270靶向结合，进而影响CRC细胞增殖、EMT等恶性生物学行为，从而协同影响CRC发展过程。

综上，CRC组织中lncRNA TUSC7表达水平较低，miR-1270表达水平较高，二者呈负相关，且lncRNA TUSC7、miR-1270均与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、分化程度、预后等显著相关，为临床诊治CRC、判定CRC患者预后提供新方向。但本研究样本有限，后期将延长随访时间，扩大样本，从多角度探究lncRNA TUSC7、miR-1270与CRC的关系，以增加实验可靠性。