蛹虫草多糖的抗氧化活性研究

雷燕妮，张小斌，陈书存

(1 商洛学院 a 生物医药与食品工程学院，b 健康管理学院，陕西 商洛 726000；2 陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000；3 商洛市中医医院，陕西 商洛 726000)

蛹虫草(CordycepsmilitarisL.)隶属于子囊菌门麦角菌科虫草属，又称北冬虫夏草或北虫草。作为传统名贵中药材，蛹虫草在功能食品和药品方面具有重要的实用价值，现已被国家卫生部批准为新资源食品[1-2]。孟泽彬等[3]研究表明，蛹虫草化学成分主要有核苷类、虫草多糖、虫草甾醇和糖醇类、黄酮类以及多种蛋白质、氨基酸等，此外，其还富含多种微量元素[4]。已有研究表明，蛹虫草具有非常广泛的药理活性，如具有抗菌消炎、镇痛抗疲劳、抗衰老、抗氧化和抗肿瘤等方面的功效。

作为蛹虫草的主要活性物质，蛹虫草多糖(Cordycepsmilitarispolysaccharide,CMPs)具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降糖保肝和免疫调节之功效[4-6]。近年来，国内外针对蛹虫草多糖的研究较多集中在分离纯化工艺优化[7]、多糖构型分析[8]、多糖组成[9]等方面，有关蛹虫草多糖的药理活性研究多集中于体外抗氧化和保护肝损伤方面[10-12]，而对于蛹虫草多糖体内和体外抗氧化活性进行系统性研究的报道很少见，如吴杨洋等[7]研究表明,蛹虫草多糖具有一定的体外清除DPPH自由基和羟自由基能力及还原力，而未涉及体内抗氧化活性；江琦等[8]研究发现，蛹虫草多糖具有体外清除DPPH自由基和ABTS自由基的作用，亦未涉及体内抗氧化活性的研究。因此本研究着重探讨蛹虫草多糖体内和体外抗氧化活性，旨在为蛹虫草多糖抗衰老药物研发提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草，购自徐州鸿宇农业科技有限公司，经西北大学生命科学学院植物教研室李智选研究员鉴定为麦角菌科虫草属真菌蛹虫草；二乙氨基乙基纤维素52(DEAE cellulose DE-52)，购自上海源叶生物科技有限公司；羟自由基测定试剂盒，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和2,3-喹啉二甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；无水葡萄糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，均购自上海Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为国产分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2 主要仪器与设备

RT6000型酶标分析仪，购自深圳雷杜生命科学股份有限公司；7600CRT双光束紫外可见分光光度计，购自上海菁华科技仪器有限公司；DBS-100N型自动部分收集器、DHL-B型数显恒流泵，购自上海沪西分析仪器有限公司；BK-FD12PT型立式冷冻干燥机，购自山东博科科学仪器有限公司；TGL-16M型低温高速冷冻离心机，购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 蛹虫草多糖的分离纯化

取适量蛹虫草子实体粉末(m粉)，参照雷燕妮等[13]多糖制备方法在微波辅助下提取蛹虫草多糖，蛹虫草粗多糖含量采用苯酚-硫酸法[14]测定。采用DEAE-52纤维素柱色谱法分离纯化蛹虫草多糖，采用苯酚-硫酸法[14]检测每管总糖含量，并绘制以管数为横坐标，吸光值(波长492 nm)为纵坐标的洗脱曲线；依据洗脱曲线收集不同吸收峰段的多糖组分，将收集到的组分真空冷冻干燥即得蛹虫草多糖粉末(CMPs)，精确称量质量(m多糖)，按下式计算多糖产率。采用BCA试剂盒测定多糖粉末中蛋白质含量[15]，采用福林酚法[16]测定总酚类成分含量。

多糖产率=m多糖/m粉×100%。

式中：m多糖为分离纯化后经冷冻干燥的蛹虫草多糖质量(g)，m粉为提取时称取的蛹虫草子实体粉末质量(g)。

1.4 蛹虫草多糖的体外抗氧化活性评价

精密称取一定量的CMPs配制成10 mg/mL原液，分别用蒸馏水稀释至0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL，以相同质量浓度梯度的维生素C(Vc)为阳性对照，分别测定上述待测样品和对照溶液对羟自由基、超氧阴离子、ABTS自由基和DPPH自由基的清除作用，按照参考文献[13,16]的方法依次加入相应反应试剂，测定吸光度值，每个质量浓度重复5次，计算蛹虫草多糖和Vc对各自由基的清除率(IR)：

IR=[(OD样品-OD本底)/OD对照]×100%。

式中：OD样品为样品(多糖样品+ABTS)的吸光度值，OD对照表示阴性对照(ABTS+样品溶剂)的吸光度值，OD本底为本底吸光度值。其他自由基体系计算方法与此类似。

以蛹虫草多糖(CMPs)质量浓度为横坐标，以各自由基清除率为纵坐标绘制曲线，采用Excel软件计算样品对各自由基的半数有效质量浓度(EC50)。

1.5 蛹虫草多糖体内抗氧化活性评价

1.5.1 试验动物选择 Specific pathogen free(SPF)级昆明(KM)小鼠60只，雌雄各半，体质量15～20 g/只，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2019-001，饲养温度20～25 ℃、相对湿度45%～75%。

1.5.2 动物分组及试验小鼠衰老模型建立 60只昆明小鼠适应性饲养1周，随机分为2组，正常对照组10只，模型组50只。模型组小鼠颈部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)，注射剂量为10 mL/kg，每天注射1次，连续注射5周；正常对照组小鼠颈部皮下注射等量生理盐水。5周后衰老模型组小鼠体质量增长情况较正常对照组迟缓，且出现毛色暗淡、饮食量下降、反应迟缓、喜睡眠等典型衰老特征，表明造模成功[17-19]。随后将50只模型组小鼠随机分为5组，每组10只，即模型对照组、阳性对照组(Vc，100 mg/mL)、蛹虫草多糖高剂量组(300 mg/mL)、中剂量组(200 mg/mL)和低剂量组(100 mg/mL)，灌胃剂量为10 mL/kg，每天1次，连续灌胃时间5周。给药期间正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水。

1.5.3 体内抗氧化指标测定 体质量：建模成功后每周测量小鼠体质量1次，观察小鼠体质量变化情况。

脏器指数：小鼠颈椎脱臼处死后，分离出胸腺、脾脏和脑，用滤纸吸干净表面血液并称质量，按下式计算相应脏器指数：

脏器指数=脏器质量(g)/小鼠体质量(g)。

抗氧化相关指标：小鼠末次给药后饥饿过夜，次日处死后摘眼球取血，加抗凝剂静置1 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清液于4 ℃保存。采用羟自由基测定试剂盒检测小鼠血清羟自由基的抑制能力[20]；硫代巴比妥酸法[17-19]测定MDA含量；羟胺法[17]测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；可见光比色法[17]测定过氧化氢酶(CAT)活性；DNTB速率比色法[18-19]测定谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。所有指标测定均严格参照试剂盒操作说明进行。

1.6 数据处理

试验数据除特殊说明外均采用“平均值±标准差”的形式表示，采用SPSS 19.0软件计算均值、标准差，并用配对t检验和两样本均数比较t检验检测显著性。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草多糖的分离纯化与定性分析

利用DEAE-52的吸附效应，对提取的蛹虫草多糖进行分离纯化，洗脱曲线如图1所示。

从图1可以看出，不同质量浓度氯化钠溶液洗脱蛹虫草多糖能够得到2个峰(管18～25和管55～70)，因第1个峰面积和管数较小，无进一步深入研究价值。故后续试验收集第2个洗脱峰溶液，浓缩、透析后进行真空冷冻干燥，得到蛹虫草多糖(CMPs)，其多糖产率为8.23%。

按照1.3节的苯酚-硫酸法测得DEAE-52纯化前后蛹虫草多糖提取物中总糖含量分别为51.83%和82.57%。运用BCA试剂盒法测定纯化后CMPs中蛋白质质量分数为3.27%，福林酚法未检出总酚类成分。由此可见，相比蛹虫草粗多糖含量，DEAE-52纤维素柱色谱法显著提高了提取物中多糖的质量分数，可用于后续相关生物活性研究。

2.2 CMPs的体外抗氧化活性

2.2.1 对羟自由基的清除能力 从图2-A可以看出，在试验质量浓度范围内(0.5～3.0 mg/mL)，CMPs质量浓度与羟自由基(·OH)的清除率之间呈良好的质量浓度依赖关系，CMPs质量浓度越大其对·OH的清除率愈高。当CMPs质量浓度从0.5 mg/mL增加到3.0 mg/mL时，其对·OH的清除率则从13.8%上升到88.3%；在0.5～1.5 mg/mL质量浓度范围内，CMPs对·OH的清除率增幅较缓；而在1.5～3.0 mg/mL时呈现快速增长的趋势；经Excel软件计算，CMPs对·OH清除的半数有效质量浓度(EC50)为1.912 mg/mL。

由图2-A还可以看出，CMPs在较低质量浓度时对·OH的清除率显著低于同质量浓度阳性对照(VC)(P<0.05)；当CMPs质量浓度达到3.0 mg/mL时，其与同质量浓度VC对·OH的清除率无显著差异。

2.2.2 对超氧阴离子的清除能力 由图2-B可以看出，CMPs对超氧阴离子的清除率与其质量浓度成线性递增趋势，经计算其EC50值为2.153 mg/mL，VC的EC50值为0.539 mg/mL，二者EC50之间存在显著差异。从图2-B还可以发现，在试验质量浓度范围内CMPs对超氧阴离子的清除能力明显弱于同剂量的阳性对照，尤其是在0.5～2.0 mg/mL的低质量浓度范围内，二者之间差异极显著(P<0.01)。当样品质量浓度为3.0 mg/mL时，CMPs和Vc对超氧阴离子的清除率分别为85.1%和100.0%，二者之间仍存在显著差异(P<0.05)。

2.2.3 对ABTS自由基的清除能力 从图3-A可以看出，CMPs对ABTS·的清除率随其质量浓度的增加呈线性递增趋势，CMPs和Vc的EC50值分别为1.612和0.578 mg/mL。随着样品质量浓度的增加，CMPs与Vc对ABTS·清除率的差距不断缩小；当CMPs质量浓度为3.0 mg/mL时，其对ABTS·的清除率为93.5%，与同剂量阳性对照Vc效果相当。

2.2.4 对DPPH自由基的清除能力 由图3-B可以看出，CMPs对DPPH·的清除率具有良好的质量浓度依存性，且随多糖质量浓度的不断增加，其对DPPH·清除率呈逐渐上升趋势。CMPs的半数有效质量浓度(EC50)为2.058 mg/mL，Vc的EC50为0.269 mg/mL，二者之间存在显著差异(P<0.05)。当CMPs质量浓度达到3.0 mg/mL时，其对DPPH·的清除率为88.3%，接近相同剂量的阳性对照(VC)。

2.3 CMPs的体内抗氧化活性

2.3.1 对小鼠体质量的影响 在整个试验期间，各组小鼠均正常生长，无异常死亡情况发生。从表1可以看出，各试验组小鼠初始体质量无显著差异(P>0.05)，适应饲养第1周后发现各组小鼠均正常健康生长，组间体质量无显著差异。衰老模型造模完成后的第6周发现，与正常对照组相比，所有模型组小鼠体质量增加趋势明显缓慢，且模型组小鼠开始出现毛色暗淡以及毛发脱落、反应迟钝、行动迟缓和精神萎靡等典型的衰老特征。药物处理结束的第11周发现，相较于正常对照组，其余各组小鼠体质量增加显著缓慢(P<0.05)；同模型对照组相比，CMPs及Vc处理组小鼠体质量均有不同程度增加，且随着CMPs剂量的增加，小鼠体质量增加明显。说明CMPs及Vc处理能够缓解小鼠衰老现象。

2.3.2 对小鼠脏器指数的影响 从表2可以看出，相较于正常对照组，模型对照组小鼠的肝脏、脾脏和脑指数显著降低(P<0.05)，而胸腺指数亦呈现明显降低趋势，说明模型对照组小鼠各脏器呈现明显的萎缩现象，表明D-半乳糖造模成功。与模型对照组比较，阳性对照组(VC)能显著增加模型小鼠的肝脏、胸腺和脾脏指数(P<0.05)；脑指数也逐渐恢复到正常状态，但无显著差异(P>0.05)；CMPs能明显增加模型小鼠肝脏、胸腺、脾脏和脑指数，其中CMPs高剂量组小鼠的肝脏、胸腺、脾脏和脑指数显著升高(P<0.05)。表明蛹虫草多糖能缓解小鼠的衰老现象。

表2 蛹虫草多糖对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of CMPs on organ indexes in mice g/kg

2.3.3 对小鼠血清羟自由基抑制能力的影响 从表3中可以看出，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清中羟自由基抑制能力显著下降(P<0.05)。不同质量浓度CMPs对羟自由基的抑制能力差异显著(P<0.05)，同时从抑制率可以看出CMPs高剂量组(62.57%)>中剂量组(51.28%)>低剂量组(41.93%)，说明CMPs对小鼠血清中羟自由基的抑制能力与其质量浓度呈正相关。同模型对照组相比，阳性对照组Vc和CMPs高剂量组极显著提高血清羟自由基抑制能力(P<0.01)，且二者作用不相上下；CMPs中剂量组可以显著提高小鼠血清羟自由基抑制能力，CMPs低剂量组的作用稍弱。这一试验结果与前人的研究结果[18-20]一致。

表3 不同灌胃组小鼠血清羟自由基抑制能力的测定结果Table 3 Determination of serum ·OH in mice in different gavage groups

2.3.4 对小鼠血清中MDA含量，T-SOD、CAT和GSH-Px活力的影响 由表4可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-Px活力显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比，阳性对照组(Vc)显著提升模型小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-Px活力(P<0.05)，同时极显著降低MDA含量(P<0.01)；CMPs高、中剂量组也显著提高模型小鼠血清中T-SOD、CAT和GSH-Px活力(P<0.05)，CMPs高剂量组则极显著降低了MDA含量(P<0.01)；CMPs中剂量组则显著降低了MDA含量(P<0.05)。

表4 小鼠血清中的MDA含量及T-SOD、CAT和GSH-Px活力Table 4 MDA content and T-SOD,CAT and GSH-Px activities in serum of mice

2.3.5 对小鼠肝组织中MDA含量，T-SOD、CAT和GSH-Px活力的影响 由表5可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝组织中T-SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)，CAT活力明显下降但与正常对照组相比无显著性差异，MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组相比，阳性对照组(VC)显著或极显著提高了模型小鼠肝组织中T-SOD、CAT和GSH-Px的活力，显著降低了MDA的含量；CMPs高、中剂量组极显著或显著提高了模型小鼠肝组织中T-SOD、CAT和GSH-Px的活力(P<0.01或P<0.05)，且显著降低MDA的含量(P<0.05)，尤其是CMPs高剂量组对3种酶活力升高和MDA含量的降低均达到极显著。

表5 小鼠肝脏组织中的MDA含量及T-SOD、CAT和GSH-Px活力Table 5 MDA content and T-SOD,CAT and GSH-Px activities in liver tissues of mice

综上所述，蛹虫草多糖能够明显增强小鼠血清和肝脏组织中T-SOD、CAT和GSH-Px活力，并在一定程度上降低机体MDA含量，能有效缓解D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的衰老症状，表明其具有较好的体内抗氧化能力。

3 讨 论

衰老作为机体生物学进化过程中的一种自然现象，其内在机制和应对策略一直是学界研究的热点，用以解释衰老自由基学说备受关注[21]。Harman[22]认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生自由基的有害作用造成的。因此开展机体自由基清除方面的研究意义深远。现阶段体内自由基清除研究多采用D-半乳糖诱导的动物衰老模型[17-20]。机体摄入过量D-半乳糖后会导致代谢紊乱，使机体各器官氧化酶活性改变，形成多种活性氧自由基，引起机体细胞损害，继而导致机体多器官萎缩和功能衰退而呈现衰老态势。由于该模型相关指标非常接近自然衰老而备受学者青睐[23]。基于此，本研究采用该方法构建衰老模型小鼠，进而探究CMPs对衰老小鼠的体内抗氧化活性。

研究表明，SOD能抑制超氧阴离子，维持机体氧化与抗氧化之间的动态平衡[24-25]。因而SOD活力强弱能够反映机体清除超氧自由基的能力，其在机体内的水平高低亦是衰老程度的直观指标。浅田浩二[26]研究表明，血清中SOD含量或活力最能反映机体的SOD水平。MDA是氧自由基损伤或细胞导致脂质过氧化的代谢产物，过量的MDA会加速机体衰老或疾病的发生[24-26]，其在血清和组织中含量的高低是衡量机体自由基代谢的敏感指标。CAT存在于机体过氧化物体内，其含量高低可间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[27]。GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，主要负责清除体内过氧化氢和有机氢过氧化物，并能够特异地催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[28]。为此，本研究在构建的衰老小鼠模型基础上，通过灌胃给药方式给予模型小鼠不同剂量CMPs，详细检测造模前后上述各种酶活力和MDA含量变化情况，同时与正常对照加以对比，结果发现CMPs能够明显改善衰老模型小鼠血清和肝组织当中的T-SOD、CAT和GSH-Px活力，且能显著降低MDA含量，说明其具有良好的体内抗氧化活性。这一研究结果与近期有关天然多糖体内抗氧化研究的结论[29-31]是一致的。为了更充分说明蛹虫草多糖的抗氧化活性，本研究在体内试验的同时还考察了其体外抗氧化活性，结果表明蛹虫草多糖同样表现出良好的体外抗氧化活性，可见蛹虫草多糖具有开发成天然抗氧化剂和绿色保健食品的潜能。

4 结 论

本研究通过水提醇沉法制备蛹虫草粗多糖，再而采用DEAE-52纤维素柱色谱法纯化得到CMPs组分。体外抗氧化活性测定结果表明，其对羟自由基、超氧阴离子、ABTS·和DPPH·均有良好的清除作用，EC50分别为1.912，2.153，1.612和2.058 mg/mL。体内抗氧化活性测定结果表明，CMPs能显著提高衰老模型小鼠血清和肝脏组织中的T-SOD、CAT和GSH-Px活力，且能显著降低MDA含量，并且呈现良好的质量浓度依赖关系，尤其是CMPs高剂量时可以使衰老小鼠相关指标恢复到或接近正常水平。