连作和感病对烟株根际土壤真菌群落结构的影响

敖金成，周桂夙，李永梅

(云南农业大学 a植物保护学院，b烟草学院，云南 昆明 650201)

健康优质的耕地资源对现代农业可持续发展至关重要。微生物在维持土壤质量及推动土壤健康发展方面具有十分重要的作用[1]。植物根际环境是一个特殊的生态系统，其与非根际土壤在生物学、化学等特性上具有显著差异[2]。根际是植物根系、有益微生物和病原微生物同宿主植物发生相互作用的一个区域，蕴含着丰富的微生物资源[3]，而病原菌的成功侵染必然经过“根际”[4]。近年来，根际微生物与植物病害发生的关系已成为研究的热点之一。正如杨珍等[4]指出，了解根际微生物与病害发生的互作关系，有利于从微生物种群、功能代谢和抑病物质等方面研究找出防控土传病害的有效方法。

烟草为茄科忌连作作物，是我国重要的经济作物之一。在诸多的烟草病害中，烟草根腐病是一种典型的土传侵染性病害，具有危害面广、防治难度大等特点，常与烟草黑胫病、青枯病、黑根腐病等根茎类病害混合发生，也可单独发生。研究表明，镰刀菌属(Fusariumsp.)是引起烟草根腐病的主要病原菌[5-6]，其通过分泌毒素[7]、伤害烟草的维管束组织和根系组织[6]等方式对烟草侵染。烟草连作后真菌群落结构的变化可能是引发烤烟连作障碍的主要原因之一[8]。郑元仙等[9]研究认为，感病根际土壤真菌群落结构改变及物种多样性降低是烤烟根腐病发生的重要特征。上述主要研究了感病烟株根际土壤真菌群落演化特征，但连作与感病互作对烟株根际土壤真菌群落结构及多样性影响鲜见报道。李朋发等[10]基于FUNGuild对镰刀菌根腐病发病烟株根际土壤真菌群落研究认为，高通量测序与FUNGuild联用可对土传病害感病烟株根际土壤的优势病原真菌群落进行准确鉴定。为此，本研究基于ITS高通量测序技术探索不同连作年限烟田健株与病株根际土壤真菌群落组成、多样性及其与土壤环境因子关联性特征，揭示连作与感病交互作用对连作土壤微生态环境的影响，为定向优化根际土壤微生态环境，创新土传病害的防控方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 连作土壤采集区概况

试验点地处云南省红河州泸西县白水镇(103°52′26″ E，24°40′03″ N)，海拔1 878.5 m，年均温16.0～18 ℃，属于北亚热带季风气候区，烤烟大田生育期降水量740.0～810.0 mm。近年来烟田连作现象较为普遍，长期连作烟田占比较大。

1.2 试验设计及样品采集

于2020年7月烤烟成熟期分别对连作2年(T2)、4 年(T4)和8 年(T8)烟田健株(以下简称‘健株’，分别用HT2、HT4、HT8表示)和根腐病感病烟株(以下简称‘病株’，分别用ST2、ST4、ST8表示)根际土壤进行取样。取样时去除地表杂物，然后将烟株整株挖起并去除根系外围土，采用抖根法[11]，轻轻抖落并收集须根2 mm范围内土壤。对照(CK)为同区域撂荒2 年以上耕层土壤(0～20 cm)，未种植任何作物。同一连作年限健株与病株各取4个点，即4次重复，取样点间距20 m，每个取样点随机选取3株烤烟采集根际土壤制成混合样。用于化学性质检测的土壤样品用自封袋密封带回实验室自然风干后过筛备用；用于真菌群落高通量测序分析的样品用冷冻管分装，保存于4 ℃车载冰箱迅速带回实验室后保存于-80 ℃冰箱。供试烤烟品种为烟草根腐病高抗品种云烟87。供试土壤类型为红壤。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 土壤化学性质 土样风干磨细过筛后备用。土壤碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量和pH值的测定参照文献[12]的方法进行。

1.2.2 土壤真菌群落结构及多样性 基于高通量测序分析连作条件下健株和病株根际土壤真菌群落组成及多样性。

(1)基因组DNA的提取。采用土壤DNA提取试剂盒HiPure Soil DNA Kits(Magen，中国广州，cat#3412)。首先，在2 mL珠管中加入0.25～0.50 g土壤样品和0.6 mL 缓冲溶液，利用涡旋仪(米欧mix-28+，广州围古润仪器)充分匀浆裂解，然后于70 ℃水浴10 min，离心后收集管壁上液滴，加入200 μL聚苯乙烯缓冲液 和150 μL吸收溶液，涡旋混匀20 s，静置5 min后离心5 min，取上清液至2 mL离心管，加入等体积5′-二磷酸鸟苷二钠缓冲液，混匀以获得DNA柱。然后用1%琼脂糖(Biowest Agarose，西班牙)凝胶电泳(DYY-6C,北京六一仪器厂)检测基因组DNA的完整性及是否发生蛋白等污染，然后将DNA样品于-80 ℃条件下保存待用。

(2)目的基因扩增及Illumina测序。目的基因扩增及Illumina测序方法如下：采用带有Barcode标记的特异引物 (ITS3-KYO2:GATGAAGAACGYAGYRAA;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATA-TGC)对真菌核糖体基因片段上的转录间隔区(ITS)进行MiSeq扩增子测序。PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 聚合酶，每个样本3次PCR重复，扩增后将PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。使用AMPure XP Beads对第2轮扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus RealTime PCR System(Life Technologies,美国)进行定量，最后利用Illumina MiSeq PE250模式进行高通量测序。

1.3 数据处理与统计分析

真菌操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)和Alpha多样性数据采用Excel(2017)进行分析，处理间差异显著性分析采用IBM Statistics SPSS 20.0的Duncan’s新复极差法。生信分析利用软件平台Usearch(version 7.0)对相似度在97%条件下的OTUs进行质控拼接和tag聚类去嵌合体，获得tag序列和丰度。真菌群落组成使用R语言的Pheatmap包绘制物种丰度热图。利用软件Mothur(version v.1.30.1)计算反映群落丰富度的Sobs指数、反映群落多样性的Shannon-Weiner 指数和用于评估多样性程度的PD-whole tree(PD)指数。利用Vegan包进行主坐标分析(principal co-ordinate analysis,PCoA)，并采用Anosim检验进行分组信息检验，以评价样本间的Beta多样性特征。采用Labdsv包计算样本中丰度值>0且总占比>0.1%的物种在每个分组的Indicator值，并使用Cross-validation进行统计检验，获得P值。Indicator分析基于物种在样本中的丰度和出现频率，计算各物种在每个分组的Indicator值，Indicator数值越大，表示物种可能是该分组的指示物种。采用Vegan包进行冗余分析(redundancy analysis，RDA)和绘图，Psych包进行土壤化学性质与真菌物种相对丰度之间的Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 连作烟田健株和病株根际土壤真菌OTUs数

不同连作年限烟田健株和病株根际土壤真菌OTUs数见图1。

基于97%序列相似性要求，共获得113 134个有效序列，聚类得到517个真菌OTUs。从图1可以看出，与CK相比，不同连作年限烟田HT2、HT4、HT8健株OTUs数降幅分别为2.9%，24.7%和50.2%，ST2、ST4、ST8病株OTUs数降幅分别为14.7%，37.8%和58.1%，随连作年限的延长，健株和病株根际土壤OTUs数呈现明显减少趋势，但同一连作年限病株OTUs数降幅大于健株，短期连作(2～4年)土壤OTUs数降幅低于长期连作(8年)土壤。

2.2 连作烟田健株和病株根际土壤微生物群落丰度

由图2-a可以看出，青霉菌属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、被孢霉属(Mortierella)、淡紫紫孢菌属(Purpureocillium)、圆孢霉属(Staphylotrichum)、Fusicolla、毛壳菌属(Chaetomium)、异茎点霉属(Paraphoma)、鬼伞属(Coprinellus)、Sistotrema、曲霉属(Aspergillus)、Coelastrella、茎点霉属(Phoma)、链格孢属(Alternaria)、Setophoma、Spizellomyces、Plectosphaerella、Cladorrhinum、Roussoella是撂荒土壤和不同连作年限烟田健株和病株根际土壤排前19位的优势菌属，累积相对丰度总和为20.5%～54.9%，其中HT2样本的优势菌群累积相对丰度总和(20.5%)最低，CK样本(36.4%)次之，ST8样本最高，达54.9%。与CK相比，HT2、HT4和HT8样本优势菌群累积相对丰度总和降幅分别为14.1%，43.9%和11.5%，ST2和ST8样本优势菌群累积相对丰度总和增幅分别为9.4%和50.9%，而ST4降幅为4.5%。

由图2-a还可知，与CK相比，HT2、HT4样本镰刀菌属相对丰度增幅分别为226.8%和149.2%，ST2和ST4样本增幅分别为665.1%和81.3%，而HT8和ST8样本降幅分别为44.0%和32.9%；HT2、HT4和HT8样本淡紫紫孢菌属相对丰度降幅分别为960.8%，1 387.1%和295.2%，而ST2、ST4和ST8样本降幅分别为1 107.1%，653.4%和1 373.9%；HT4和HT8样本土壤青霉菌属相对丰度增幅分别为17.0%和1 907.1%，ST2、ST4和ST8样本土壤青霉菌属相对丰度增幅分别为82.1%，965.9%和3 529.7%；毛壳菌属相对丰度演化规律不明显。

由图2-b可以看出，与CK相比，HT2、HT4样本茄腐镰刀菌(F.solani)相对丰度增幅分别为270.5%和187.4%，ST2和ST4样本增幅分别为844.3%和88.5%，而HT8、ST8样本降幅分别为37.8%和24.5%。

2.3 连作烟田健株与病株根际土壤真菌群落Alpha多样性

从表1可以看出，随烟田连作年限的延长，HT2、HT4和HT8样本与ST2、ST4和ST8样本根际土壤真菌群落Alpha多样性均呈降低趋势，其中Sobs指数显著降低(P<0.05)，PD指数极显著降低(P<0.01)，Shannon-Weiner 指数整体呈降低趋势。与CK相比，除HT2样本Shannon-Weiner 指数提高1.7%外，HT4和HT8样本Shannon-Weiner 指数分别下降20.9%和42.2%，ST2、ST4和ST8样本分别下降22.4%，24.4%和38.0%。与CK相比，HT2、HT4和HT8样本的PD指数降幅分别为2.5%，18.5%，42.2%，ST2、ST4和ST8样本的PD指数降幅分别为14.1%，32.2%和48.0%。综上所述，随连作年限的延长，土壤真菌群落丰富度、多样性及多样性程度明显锐减，且病株降幅整体大于健株。

表1 不同连作年限烟田健株和病株根际土壤真菌群落Alpha多样性Table 1 Alpha diversity of rhizosphere soil fungal communities of healthy and diseased plants of different continuous cropping tobacco fields

2.4 连作烟田健株与病株根际土壤真菌群落Bate多样性分析

由图3可以看出，不同连作年限健株和病株根际土壤真菌群落结构差异明显，第1、2主成分轴对真菌群落结构变异的解释量分别为27.56%和23.80%。CK样本与其他连作烟田健株和病株样本距离较远，其中连作2年和4年烟田的健株和病株土壤样本距离较近，说明其土壤真菌群落结构较为相似，连作8年烟田的健株和病株土壤样本均较其他样本距离远。Anosim(analysis of anosim)检验结果(表2)进一步表明，连作2年烟田的健株与病株根际土壤样本间存在显著差异，P值为0.031;连作4年和连作8年烟田的健株与病株根际土壤样本间差异不显著。不同连作年限健株间、不同连作年限病株间以及不同连作年限健株与病株间根际土壤真菌的群落结构R2值分别为0.793，0.719和0.677，P值均为0.001，说明各样本组间与组内差异均达到极显著性水平。

2.5 连作烟田健株与病株根际土壤真菌群落指示物种

从图4可以看出，高山被孢霉菌(Mortierellaalpina)，Saitozymapodzolica和Lobomonasfrancei为CK样本的指示物种，其相对丰度分别为0.74%，0.87%和0.80%，均显著或极显著高于其他样本。Oidiodendroncereale、Mycothermusthermophilus和Stemphyliumsp为HT2样本的指示物种，其相对丰度分别为0.68%，0.73%和0.79%，均显著或极显著高于其他样本。Lophiotremarubi为HT4样本的指示物种，其相对丰度(0.66%)显著高于其他样本。Filobasidiummagnum和绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)真菌为ST8样本的指示物种，其相对丰度分别为0.65%和0.67%，均显著高于其他样本(P<0.05)。综上所述，撂荒土壤、连作2年土壤指示物种相对丰度较高，而连作4年和8年烟田的健株和病株真菌指示物种整体较少。

2.6 连作烟田健株和病株根际土壤真菌群落结构与土壤化学性质的相关性

2.6.1 土壤化学性质 从表3可以看出，不同连作年限烟田健株和病株根际土壤pH值以及有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量存在显著或极显著差异。与CK相比，随连作年限的增加，健株和病株根际土壤pH值极显著降低(P<0.01)，而土壤速效磷和速效钾含量极显著增加；碱解氮含量以HT4和ST4样本最高，且均显著高于CK；HT2，HT8和ST8根际土壤样本有机质含量均低于CK，其他处理显著高于CK。总体来看，连作2年(HT2和ST2)和连作4年(HT4和ST4)土壤养分含量整体一致，而连作8年(HT8和ST8)土壤pH值和有机质、碱解氮含量整体较低。同一连作年限健株根际土壤pH值整体低于病株，而速效磷含量均明显高于病株，短期连作(2～4年)健株根际土壤速效钾含量明显低于病株，而连作8年烟田健株根际土壤速效钾含量明显高于病株。

表3 不同连作年限烟田健株与病株根际土壤的化学性质Table 3 Soil chemical properties of healthy and diseased plants in tobacco fields with different continuous cropping years

2.6.2 真菌群落结构与土壤化学性质的相关性 由图5-a可以看出，连作烟田健株和病株根际土壤真菌群落第1、2排序轴贡献率累积解释变异量达到91.74%，说明排序轴能很好地反映连作烟田健株和病株根际土壤真菌群落结构和土壤化学性质之间的关系。由图5-b可知，在属水平上，土壤优势真菌群落结构与土壤化学性质存在明显的相关性。pH值与青霉菌属相对丰度呈显著负相关，而与被孢霉属相对丰度显著正相关。有机质含量与曲霉属(Aspergillus)相对丰度显著正相关。碱解氮含量与圆孢霉属相对丰度、速效钾含量与异茎点霉属相对丰度均显著负相关。pH值与被孢霉属(Mortierella)相对丰度、有机质含量与曲霉属(Aspergillus)相对丰度、碱解氮含量与圆孢霉属(Staphylotrichum)相对丰度、速效钾含量与异茎点霉属(Paraphoma)和Coelastrella相对丰度均显著相关。基于Mantel相关性(图5-c)分析表明，物种对应的样本距离和土壤化学性质对应的样本距离矩阵相关系数r为0.456，P值为0.001,说明两个矩阵极显著相关。其中以pH值对真菌物种分布的影响最大，其贡献值为7.56%；其次为速效钾含量(图5-d)。

3 讨 论

3.1 连作和根腐病感染对烟株根际土壤真菌群落组成的影响

本研究中，连作和根腐病感染整体降低了烟株根际土壤真菌优势菌属相对丰度水平，病株降幅明显大于健株，病原菌群落相对丰度增加，生防菌丰富度降低。与CK相比，3种连作年限烟田健株和病株根际土壤真菌优势菌群累积相对丰度总和整体呈降低趋势，其中病株增幅是健株的2.44～4.44倍。这与陈丹梅等[13]的研究结果连作导致真菌种群数相对减少，但优势种群突出一致。本试验中，镰刀菌属、链格孢属、异茎点霉属均是连作及感病烟株根际土壤优势真菌菌群。前人研究结果表明，土壤镰刀菌属是农作物和经济作物的重要病原菌[14]，能引起烟草根腐病感染的镰刀菌病原菌已有较多报道[5-7,15-17]。本试验中，与对照相比，HT2、ST2、HT4和ST4样本的镰刀菌属相对丰度增幅为81.3%～665.1%，种水平鉴定为茄腐镰刀菌，相对丰度增幅为88.5%～844.3%，说明茄腐镰刀菌可能是引起试验烟株感染根腐病的主要病原菌，形态鉴定有待进一步研究。HT8和ST8样本茄腐镰刀菌相对丰度下降，很可能与该烟田进行过防治黑胫病、青枯病药物灌根处理有关。链格孢属真菌是重要的植物病原菌之一[18-19]，烟草上主要引起赤星病[20]。淡紫紫孢菌属是一种重要的生防菌，在根结线虫防治方面有广泛应用[21-22]。本试验中，健株和病株样本淡紫紫孢菌属群落相对丰度降幅为295.2%～1 387.1%，说明连作烟田还存在根结线虫感染的潜在风险。可见，连作烟田根腐病感病烟株根际土壤大量病原菌成优势菌群，很可能是茄腐镰刀菌在群落的竞争中占据优势，拮抗菌因为竞争能力弱而被淘汰或被抑制，从而导致作物真菌病害的发生机率增加[13]。

3.2 连作和根腐病感染对烟株根际土壤真菌群落多样性的影响

植物与土壤之间的反馈作用一般会通过微生物进行调节[23]。目前学术界关于连作导致土壤真菌群落多样性发生趋向性改变存在不同观点。许多学者研究认为，随连作年限的增加真菌数量增加[24-25]。也有研究表明，真菌群落多样性和丰富度指数随连作年限的增加呈先上升后下降趋势[26]。也有学者研究认为，健株根际土壤中真菌多样性显著高于病株根际土壤[27-30]。本研究结果表明，随连作年限的延长，健株和病株根际土壤真菌群落多样性均不同程度降低，但整体以病株根际土壤真菌群落多样性降幅大于健株。另有学者研究认为，健株与病株根际土壤真菌群落在组成上存在差异，而真菌多样性差异不显著[31-33]。因而连作2年和4年的健株和病株根际土壤样本真菌群落结构较为相似，而与撂荒土壤和连作8年的健株和病株差距较大。

3.3 连作和根腐病感染烟株根际土壤理化性质与真菌群落分布的关系

矿质营养不仅对植物的正常生长发育起重要作用，而且以多种方式直接或间接影响病原物的侵染、繁殖及植株的感病性和抗病性[34-35]。Song等[22]研究指出，黄连(CoptischinensisFranch.)连作土壤理化性质可直接或间接影响真菌生长，进而影响真菌群落结构。土壤理化性质与硒砂瓜连作年限无显著相关性，而与土壤真菌群落结构存在显著相关性[26]。本研究结果表明，连作烟田健株和病株根际土壤真菌群落分布与土壤主要化学性质之间存在明显的关联性，其中以与pH值极显著或显著正相关或负相关的真菌种群较大，其贡献值最高，其次为速效钾含量。说明土壤pH值和速效钾含量是影响真菌群落的核心环境因子，连作土壤改良应首要调控土壤pH值和速效钾含量，可以间接调控连作土壤真菌群落结构及分布，这与刘株秀等[36]的研究结果一致。这也解释了连作烟田板结严重、易发病，而有些地块即使连作年限较长，其病害发生也较轻。

4 结 论

(1)连作和根腐病感染提高了烟株根际土壤真菌优势菌属丰富度水平，病株增幅明显大于健株，总体表现为病原菌群落丰度增加，而有益菌群落丰度降低。茄腐镰刀菌可能是引起试验烟株根腐病的主要病原菌。

(2)连作及感病促使土壤真菌群落结构单一化加剧，多样性程度降低，长期连作(4～8年)土壤样本群落组成较相似，指示物种丰度较低。

(3)土壤pH值和速效钾含量是影响连作和感病烟株根际土壤真菌群落分布的核心环境因子。