欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因多态性及其与生长性状的关联分析

谭义洲，丁考仁青，褚 敏，郭 宪，马晓明，包鹏甲，阎 萍，梁春年

(1 中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050；2 甘南州畜牧科学研究所，甘肃 甘南 747000)

藏羊(Tibetan sheep)是中国三大粗毛绵羊品种之一，具有悠久的养殖历史。目前藏羊主要分布在我国西藏、青海、甘肃等高海拔地区[1]，依据其生态环境，结合自身的生产及经济特点可分为高原型、山谷型和欧拉型3大类。藏羊对高海拔地区的各种极端环境适应性很强，且具有生长发育快、育肥性能好等特点，是高原畜牧业中的珍贵物种资源[2-3]，目前有关藏羊遗传学和分子生物学方面的研究仍处于较低水平。

解偶联蛋白(uncoupling protein,UCPs)是一种线粒体内膜蛋白，广泛分布在动物各种组织中。其能消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，导致利用质子浓度差驱动的氧化磷酸化过程减慢，阻碍了三磷酸腺苷(ATP)的正常产生，使能量以热量形式消散[4]。UCP2是UCPs家族里的一员，其在调节能量代谢、胰岛素分泌、活性氧(ROS)产生以及细胞代谢、细胞增殖和细胞死亡等不同细胞过程中发挥着重要作用[5-6]。UCP3和UCP2基因紧密连锁定位于藏羊的15号染色体上，当受到脂肪酸刺激时，UCP3基因表达量上调，且其蛋白会参与脂肪酸和其他阴离子的跨膜转运[7]。UCP3基因的活性对氨基酸代谢和脂肪酸氧化及相关的生化途径具有重要调节作用[8]。国鹏等[9]研究发现，黑安格斯牛UCP2-655和UCP3-5465基因多态性位点与其生长性状显著相关。艾锦新等[10]采用直接测序法检测黔北麻羊UCP2基因的SNP位点，发现4个SNPs位点对生长性状有显著影响。郝军等[11]通过直接测序法对麦洼牦牛UCP2和UCP3基因多态性位点进行检测，共发现4个突变位点，其中UCP2基因T1499C位点CT基因型个体的体质量显著高于TT型。

目前对于藏羊UCP2和UCP3基因多态性与其生长性状的关联分析尚未见报道，本研究以UCP2和UCP3作为候选基因，测定欧拉型藏羊的生长性状，探讨该基因多态性与藏羊生长性状的关联性，以期筛选欧拉型藏羊分子育种良好的辅助分子标记，进而为欧拉型藏羊的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

自甘南地区采集自然放牧的成年健康欧拉型藏羊239头，每头使用含有ACD抗凝的真空采血管颈静脉采血10 mL，轻微振荡摇匀后置-20 ℃冰箱保存备用。同时测定并记录每头藏羊的体质量、体高、体斜长、胸围等体尺性状。

1.2 主要试剂及仪器

EasyPure®Blood Genomic DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒、2×EasyTaq®PCR SuperMix，均购自全式金生物技术有限(北京)公司；NanoDrop 2000紫外分光光度计、PCR仪，均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DYY-6C型电泳仪，购自北京市六一仪器厂；天能Tanon2500全自动数码凝胶成像分析系统，购自上海天能科技有限公司。

1.3 血液样品DNA的提取

采用EasyPure®Blood Genomic DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒，对欧拉型藏羊的全血基因组DNA进行提取，用紫外分光光度计检测其质量和浓度，将合格的DNA置于1.5 mL离心管中，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank公布的藏羊UCP2(登录号为NM_001280682.1)、UCP3(GenBank登录号为NM_001308581.1)及试验已知信息，分别对UCP2基因第4，5，6和7外显子以及UCP3基因第3，4外显子和部分内含子区域设计特异性引物(表1)，引物送西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

表1 本研究引物序列信息Table 1 Primer sequence information in this study

1.5 UCP2和UCP3基因PCR扩增及遗传多态性分析

PCR扩增体系10 μL:2×EasyTaq®PCR SuperMix 5 μL，DNA模板(100 ng/μL)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，蒸馏水3.4 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，不同退火温度(表1)下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃冰箱保存备用。将PCR扩增产物送西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。使用SeqMan软件拼接测序所得结果序列并筛选其套峰位点，再采用MEGA 5.1软件与参考序列进行对比，初步确定其SNP位点，再以其为模板扩增相应的序列，对每个SNP位点进行分型。根据基因型统计分析结果计算基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)(PIC>0.5为高度多态；0.5>PIC>0.25为中度多态；PIC<0.25为低度多态)、基因杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并进行Hard-Weinberg平衡(HWE)适应性检验。

1.6 数据统计与分析

利用SPSS 21.0中GLM模型的单因素方差分析(One-Way ANOVE)，结合Duncan’s对不同基因型个体的生长性状进行差异显著性分析，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因的PCR扩增

以欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因组DNA为模板进行PCR扩增，所得扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1和图2所示。由图1可知，UCP2基因第4外显子扩增条带大小为631 bp，第5,6外显子扩增条带大小为777 bp，第7外显子扩增条带大小为635 bp。由图2可知，UCP3基因第3外显子扩增条带大小为282 bp，第4外显子扩增条带大小为314 bp。扩增产物与预期目的条带大小一致，可直接用于后续试验。

2.2 欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因PCR扩增产物的测序及SNPs位点筛选

通过对欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因PCR产物进行测序，再根据测序结果进行SNPs位点筛选和基因分型分析，结果见图3和图4。

图3显示，在UCP2基因的扩增产物g.52130414 C>T、g.52130584 G>A和UCP3基因的扩增产物g.52157335 C>T均发现SNP位点，即测序峰图出现不同类型的峰。由图4可见，g.52130414 C>T产生了CC、CT和TT 3种基因型，g.52130584 G>A产生了AA、AG和GG 3种基因型，g.52157335 C>T产生了CC、CT和TT 3种基因型。

2.3 欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因遗传多态性分析

对欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因确定的3个突变位点进行遗传多态性分析，结果(表2)表明,在UCP2基因g.52130414 C>T突变位点中，等位基因C为优势等位基因，CT为优势基因型，纯合度为0.535，杂合度为0.465，有效等位基因数为1.87，多态信息含量为0.357，属于中度多态位点；在UCP2基因g.52130584 G>A突变位点中，等位基因G为优势等位基因，GG为优势基因型，纯合度为0.643，杂合度为0.357，有效等位基因数为1.554，多态信息含量为0.293，属于中度多态位点；在UCP3基因g.52157335 C>T突变位点中，等位基因T为优势等位基因，TT为优势基因型，纯合度为0.561，杂合度为0.439，有效等位基因数为1.784，多态信息含量为0.343，也属于中度多态位点。卡方(χ2)检验结果显示，3个SNPs位点均符合Hard-Weinberg平衡(HWE)适应性检验(P>0.05)。

表2 欧拉型藏羊UCP2、UCP3基因多态位点遗传多态性分析Table 2 Genetic polymorphism analysis of UCP2 and UCP3 in Oula-type Tibetan sheep

2.4 欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNPs位点不同基因型与生长性状的关联分析

将欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNP位点不同基因型与其体质量、体高、体斜长和胸围4个生长性状指标进行关联分析，结果如表3所示。由表3可知，UCP2基因g.52130414 C>T位点TT基因型体质量显著高于CT基因型(P<0.05)；g.52130584 G>A位点AA基因型体质量和体斜长均极显著高于AG和GG基因型(P<0.01),AA和GG基因型胸围均显著高于AG基因型；UCP3基因g.52157335 C>T位点CC基因型体质量显著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型胸围显著高于CT基因型(P<0.05)。其余生长性状在各基因型之间差异均不显著(P>0.05)。

表3 UCP2和UCP3基因SNPs位点多态性与欧拉型藏羊生长性状的关联分析Table 3 Association analysis of SNPs polymorphisms of UCP2 and UCP3 genes with growth traits of Oula-type Tibetan sheep

2.5 欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因SNPs位点基因型组合与生长性状的关联分析

生物的生长性状并非只由单个位点进行调控，而是多个位点共同调控的结果[12]。将3个SNPs位点组合成双倍型进行分析，结果发现UCP2和UCP3的SNPs位点基因型组合共有11种，因不具备统计意义，剔除其中发生频率低于0.05的6种组合，再对剩余5种基因型组合与欧拉型藏羊进行生长性状的关联分析，结果见表4。

由表4可知，D5型欧拉型藏羊体质量极显著高于D1、D2、D3型(P<0.01)；D5型欧拉型藏羊体高显著高于D3型(P<0.05)；D5型欧拉型藏羊体斜长极显著高于D2型(P<0.01)，且显著高于D1、D3、D4型(P<0.05)；各双倍型欧拉型藏羊胸围差异均不显著。

3 讨 论

生长性状不仅是衡量畜禽个体生长发育的重要指标，同时也在畜禽育种中发挥着重要的作用，能反映其育种价值及经济效益。本研究将基因多态性与生长性状进行关联分析，可直观地筛选出良好的分子标记以提高欧拉型藏羊的育种效率，对欧拉型藏羊的选育具有重要意义。欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因位于15号染色体上，分别由8和7个外显子组成。对于UCP2和UCP3基因，目前研究较为成熟的多是其与人体疾病的关系[13-15]，对欧拉型藏羊的相关研究仍处于初级阶段。已有研究结果表明，UCP2和UCP3基因与畜禽机体的生长发育和脂肪沉积息息相关。张继等[16]对江口萝卜猪的研究发现，UCP2基因表达量的增加不利于脂肪沉积，导致肉品质变差；蒋秋斐等[17]对西门塔尔杂种牛UCP3基因的G5465A、T8162C位点进行分析，发现GA和CC基因型会影响其体高和体斜长等性状以及后期的体质量增加速度；Kowalewska-uczak等[18]对泽西奶牛、波兰荷斯坦奶牛UCP2和UCP3基因与产奶性状的关联分析发现，2种基因均与产奶量和乳脂含量存在显著相关性。赵祎等[19]对延边黄牛UCP2和UCP3基因与生长性状进行关联分析，发现2基因均存在一处突变，且对延边黄牛的生长发育具有显著影响；Wang等[20]将秦川牛UCP2和UCP3基因多态性与肉质性状进行关联分析，证实UCP2和UCP3基因与秦川牛的肉质性状密切相关。

本研究以UCP2和UCP3基因为候选基因，通过DNA直接测序法对239头成年欧拉型藏羊进行检测，在UCP2基因第5外显子上发现2个SNPs位点，根据其在染色体上的位置分别命名为g.52130414 C>T和g.52130584 G>A，其中g.52130414 C>T产生TT、CT和CC 3种基因型，g.52130584 G>A产生AA、AG和GG 3种基因型；在UCP3第3外显子上发现1个SNP位点，命名为g.52157335 C>T，其产生CC、CT和TT 3种基因型。3个SNPs位点均是位于编码区的错义突变位点，因为编码区的核苷酸序列发生改变会导致蛋白质结构的变化，从而影响蛋白质的功能[21]。由此推测，这3个SNPs位点的突变会影响欧拉型藏羊UCP2和UCP3蛋白的生理学功能。

遗传多态性是指在同一群体中，某个基因座上存在2个或2个以上的等位基因，且等位基因的频率大于0.01的现象，其形成机制是基因突变。通过对遗传多态性的各项指标进行分析可从不同角度得到群体的遗传变异程度。群体的遗传变异程度越高，表明群体的遗传多样性越丰富，选择潜力越好，对育种改良的进行就更有利[22]。本试验对3个SNPs位点遗传多态性的分析发现，3个SNPs位点均属于中度多态位点，说明其遗传变异程度较大，具有一定的选育潜力，且3个SNPs位点均符合Hard-Weinberg平衡适应性检验。

近年来，随着分子生物技术的发展，分子育种技术已广泛运用到畜禽生产中，大大提高了育种效率，加快了育种进程[23]。目前，国内对UCP2和UCP3基因的研究多在人体上或牛、猪等畜禽上[24-26]，本研究对UCP2和UCP3基因多态性与欧拉型藏羊生长性状的关联分析发现，UCP2基因g.52130414 C>T位点TT基因型体质量显著高于CT基因型(P<0.05)；g.52130584 G>A位点AA基因型体质量和体斜长均极显著高于AG和GG基因型(P<0.01),AA和GG基因型胸围均显著高于AG基因型(P<0.05)。UCP3基因g.52157335 C>T位点CC基因型体质量显著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型胸围显著高于CT基因型(P<0.05)。体质量和胸围都是直接反映畜禽生长情况的重要指标，在基因型组合分析中，双倍型D5型的体质量极显著高于D1、D2、D3型(P<0.01)，体高显著高于D3型(P<0.05)，体斜长极显著高于D2型(P<0.01)，同时且显著高于D1、D3、D4型(P<0.05)；各双倍型藏羊胸围间均无显著差异(P>0.05)。综上所述，UCP2基因g.52130414 C>T位点的TT基因型个体在体质量、体高、体斜长和胸围生长性状上较CT和CC基因型具有更好的优势；g.52130584 G>A位点的AA基因型个体在体质量、体高、体斜长和胸围生长性状上较AG和GG基因型具有良好的优势；UCP3基因g.52157335 C>T位点的CC基因型个体在各项生长性状指标上均较CT和TT基因型具有较好的优势，因此可以分别选择TT、AA和CC基因型作为后期育种中筛选的目的基因型。根据基因型组合分析可知，D5双倍型为优势基因型，在各生长性状上圴明显优于其他双倍型，可在后期选育工作中予以优先考虑。

4 结 论

研究分析了欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因多态性与生长性状的关联性，在UCP2基因第5外显子筛选出g.52130414 C>T和g.52130584 G>A 2个SNPs位点，在UCP3基因第3外显子筛选出g.52157335 C>T 1个SNP位点，3个SNPs位点均属于中度多态位点，且属于错义突变，表明其具有较大的选育潜力，可改变欧拉型藏羊UCP2和UCP3基因表达蛋白的生理学功能。3个突变位点对欧拉型藏羊体质量、体高、体斜长和胸围皆具有显著影响；D5双倍型为优势基因型，对生长性状影响显著。可将UCP2、UCP3基因作为影响欧拉型藏羊生长性状的候选遗传标记用于育种辅助选择，为后续欧拉型藏羊的分子育种提供科学依据。