44份青海小麦品种(系)抗条锈性评价及抗条锈病基因检测

张学飞，陈建雄，刘耀霞，姚 强

(青海大学 农林科学院 青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016)

由条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麦条锈病是我国小麦主要病害之一，严重危害我国粮食安全。小麦条锈病是一种气传病害，小麦可随气流进行远距离传播[1]。该病害流行时，小麦产量损失可达到10%～70%，严重时导致绝收[2-3]。与农业栽培改进、化学防治等措施相比，培育和推广抗性品种是更经济、有效和环保的防治措施[4-5]。目前生产上应用最广泛的是高抗及免疫的抗条锈品种，这就增加了小麦条锈菌对品种的选择压力。平均而言，抗病品种在应用3～5年就失去了抗性，从而引发条锈病的大流行。迄今，中国有34个条锈菌生理小种(CYR1～CYR34)以及多个致病类群被鉴定及正式命名。

建国后的8次小麦品种更替都是由于小麦条锈菌流行和变异引起的[6-8]。2009年发现新菌系贵农22(G22-9)致病类群，对抗病基因Yr24/Yr26表现毒性，导致川麦系、小偃系、兰天系、绵农系、洮字系等在四川、甘肃种植的抗病品种丧失抗性[6,9]。此后，G22-9迅速发展成为优势小种，2016年正式命名为条中34号[6]。Yr5的亲和小种于20世纪在澳大利亚和印度均已发现，且最新报道，在甘肃天水也出现了对Yr5基因产生致病性的小种[10]。新小种出现的部分原因是抗病品种的不合理分布以及抗病基因的遗传分化。因此，为了实现小麦品种抗病性的持续性利用，合理利用抗病品种和配置抗病基因是基本措施。

青海省是我国重要的小麦条锈菌越夏菌源基地，种植的小麦品种的抗条锈性与越夏菌源相关[11]。目前，虽然已对青海省部分小麦品种进行了抗条锈性评价，但评价不够全面，对合理利用小麦抗病品种非常不利。鉴于此，本研究对青海主栽小麦品种及拟报审的小麦后备品系共44份资源，进行了抗病性鉴定以及抗条锈基因检测，明确供试材料的抗条锈性及抗病基因分布，为综合利用抗条锈基因种质资源、开发培育新的抗病品种以及品种合理布局提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试小麦材料及小麦条锈菌：供试小麦材料44份，包括青海省目前种植的主要小麦品种9份和后备品系(2020年和2021年进入青海省拟报审小麦品系)35份，均由青海省农作物种子站提供。小麦条锈病感病品种铭贤169和Taichuang 29，已知抗条锈病基因单基因系品种Avocet S/Yr5 NIL、Avocet S/Yr9 NIL、Avocet S/Yr10 NIL、Avocet S/Yr15 NIL、Avocet S/Yr24 NIL、Avocet S/Yr44NIL，均由青海省农林科学院植物保护研究所提供。小麦条锈菌生理小种CYR31、CYR32、CYR33、CYR34，均由西北农林科技大学植物保护学院詹刚明副教授提供。

试剂及仪器：2×Taq PCR Master Mix试剂，购于上海生工生物工程有限公司；DL2000 Marker、DL500 Marker，购于宝日医生物技术有限公司；离心机(Monad MiniSpeed 3300)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；电泳仪(PowerPac Universal)，爱普拜斯应用生物系统贸易(上海)有限公司；细胞组织破碎仪(BBx24B)，凯杰企业管理(上海)有限公司；PCR仪(ABI 7500 )，美国BIO-RAD公司；微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop OneC)，美国Thermo Scientific公司；凝胶成像仪(Champ Gel 6000)，爱普拜斯应用生物系统贸易(上海)有限公司。小麦抗条锈病基因Yr5[12]、Yr9[13]、Yr10[14]、Yr15[12]、Yr24[15]和Yr44[16]的侧翼标记引物信息见表1，引物由北京奥科鼎盛科技有限公司合成。

表1 抗条锈病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24和Yr44的连锁分子标记序列Table 1 Sequences of flanking markers linked to strip rust resistance genes of Yr5,Yr9,Yr10,Yr15,Yr24 and Yr44

1.2 试验方法

1.2.1 小麦全生育期抗条锈性评价 小麦全生育期抗条锈性鉴定在青海省农林科学院植物保护研究所温室进行。将供试材料播于方形培养盆，每个培养盆种一个品种(系)10～15粒种子，每个品种(系)设3次重复。待第一片叶子完全展开时，将小种CYR31、CYR32、CYR33、CYR34的夏孢子分别与滑石粉按体积比1∶20混合，用抖粉法进行接种，接种后置于10 ℃接种间黑暗保湿24 h，之后放在人工培养室，温度控制在昼15～18 ℃，夜11～14 ℃，每天光照12～14 h。待感病对照铭贤169充分发病后，按照0～9级反应型标准(表2)调查，0～6级反应型为抗病，7～9级反应型为感病[17]。

表2 小麦条锈病全生育期反应型分级及鉴定标准Table 2 Classification and identification standard of reactive type of wheat stripe rust during whole growth period

表2(续) Continued table 2

1.2.2 小麦成株期抗条锈性评价 于2021年3月下旬在西宁市大通县塔尔镇王庄村进行。对供试小麦材料按照编号播种，每份材料播种20～25粒，种植2行，行长100 cm，行距25 cm，每份材料设3次重复。在实验田四周分别种植3行感病品种Taichuang 29作为诱发行。7月下旬当对照Taichuang 29发病严重度达到80%时，对供试材料发病情况进行调查。参照农业部行业标准NY/T 2953-2016《小麦区域试验品种抗条锈病鉴定技术规程》记录反应型、严重度和普遍率。其中反应型根据小麦过敏性坏死及孢子堆产生情况分为6级标准，依次为:0级(免疫)、0；级(近免疫)、1级(高抗)、2级(中抗)、3级 (中感)、4级(高感)；严重度指病叶上夏孢子堆面积占叶片总面积的百分率，按9级标准划分：依次为0(叶片未发病)，t(微量，发病但严重度低于1%)，5%，10%，20%，40%，60%，80%和100%；普遍率指发病叶片数占调查总叶片数的百分率，用来表示发病程度，按13级标准划分，依次为0，t(1%以下)，5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%。

1.2.3 小麦基因组DNA提取与抗病基因分子标记检测 采集供试小麦材料的叶片，参考Chen等[17]的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取小麦基因组DNA，略作改良。用Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24和Yr44等抗条锈病基因的侧翼标记对供试的小麦材料进行分子检测。PCR反应体系25 μL：Ex Taq溶液12.5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，100 ng/μL模板DNA 0. 5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，退火温度 (见表1) 下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存扩增产物。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶120 V下电泳30 min后，用凝胶成像仪(Champ Gel 6000)观察扩增条带。

2 结果与分析

2.1 44份青海小麦品种(系)全生育期抗条锈性评价

全生育期抗条锈性鉴定结果(表3)表明，供试的44份小麦材料中，青麦1号、青春533和青春38等31份(70.4%)材料对CYR31表现抗病，青麦1号、青春533和青春38等35份(79.5%)材料对CYR32表现抗病，青麦1号、青春38、YZ282等35份(79.5%)材料对CYR33表现抗病，互麦13、云繁105、稷麦8号等35份(79.5%)材料对CYR34表现抗病；31份(70.4%)材料对CYR31和CYR32均表现抗性，27份(61.4%)材料对CYR31和CYR33均表现抗性，29份(65.9%)材料对CYR31和CYR34均表现抗性，31份(70.4%)材料对CYR32和CYR33均表现抗性，31份(70.4%)材料对CYR32和CYR34均表现抗性，31份(70.4%)材料对CYR33和CYR34均表现抗性；26份(59.1%)材料对CYR31、CYR32和CYR33均表现抗性，28份(63.4%)材料对CYR31、CYR32和CYR34均表现抗性，27份(61.4%)材料对CYR31、CYR33和CYR34均表现抗性，28份(63.4%)材料对CYR32、CYR33和CYR34均表现抗性；15-34-3、互紫麦1号、GY363等25份(56.8%)材料对CYR31、CYR32、CYR33和CYR34均表现抗性。

2.2 44份青海小麦品种(系)成株期抗条锈性鉴定

小麦品种成株期抗条锈性鉴定结果(表3)显示，青春533、青春39和稷麦8号等20份材料表现成株抗条锈性，占供试材料的45.4%。其中GY363和GY856表现免疫，青春533、15-34-3和HYNM19-2等11份材料表现高抗，青春38、青春39和稷麦8号等7份材料表现中抗，分别占供试材料总数的4.5%，25.0%，15.9%，其余的24份材料均表现为感病。

表3 44份青海小麦品种(系)全生育期和成株期抗条锈性鉴定结果Table 3 Identification of resistance to stripe rust of 44 Qinghai wheat varieties (lines) during whole growth period and adult plant period

2.3 44份青海小麦品种(系)抗条绣病基因分子检测

对44份青海小麦品种(系)进行Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr24、Yr44的分子侧翼标记基因检测，结果(表4)表明15-34-3、HYNM19-2、GY363等5份品种可能携带Yr5基因，占供试材料的11.3%；云繁105、稷麦8号和15-34-3等11份材料可能携带Yr9基因，占供试材料的25.0%；青春533、青春38、40-12-86等4份材料可能携带Yr10基因，占供试材料的6.8%；互紫麦1号、YGW-46、GY363等5份材料可能携带Yr15基因，占供试材料的11.3%；青麦5号、稷麦8号及15-34-3等15份材料可能携带Yr24基因，占供试材料的34.1%；宁春51、15-34-3、19399-11等8份材料可能携带Yr44基因，占供试材料的18.1%。

表4 44份青海小麦品种(系)抗条锈病基因检测结果Table 4 Detection of stripe rust resistance genes in 44 Qinghai wheat varieties (lines)

由表4还可知， 8份材料可能携带有2个抗性基因，其中08-10-8可能携带Yr5和Yr24基因，13-16可能携带Yr9和Yr10基因，稷麦8号和2018153可能携带Yr9和Yr24基因，YZ813可能携带Yr9和Yr44基因，互紫麦1号可能携带Yr15和Yr24基因，19399-11和04-1可能携带Yr24和Yr44基因；2份材料可能携带3个抗性基因，其中Hxhm18-3可能携带Yr5、Yr24和Yr44基因，40-12-86可能携带Yr10、Yr24和Yr44基因；2份材料可能携带有4个抗性基因，其中GY363可能携带Yr5、Yr9、Yr15和Yr24基因，15-34-3可能携带Yr5、Yr9、Yr24和Yr44基因；航远L621、HL679和青麦1号3个材料未检测到上述6种抗病基因。

青海省部分供试小麦主栽与后备品种抗条锈病基因分子检测结果如图1所示。

3 讨 论

青海省位于我国青藏高原与西北内陆接壤地区，海拔较高，地形地貌复杂多样，不同区域气候条件差异大，小麦种植垂直分布，具有独特的条锈病流行环境。冬、春麦区存在重叠，为小麦条锈菌周年循环提供了良好的条件，成为继甘肃陇南之后的又一小麦周年循环区[18]。准确把握青海省种质资源的抗病性以及抗性基因的分布，对遏制小麦条锈菌流行具有重要作用。

青海东部作为我国条锈菌越夏易变区，条锈菌传播与秋季自生苗生长相衔接，自生苗发病情况直接决定了冬前菌源量。姚强等[11]对青海东部麦区小麦条锈菌越冬条件进行初探，结果表明冬前菌源量是影响小麦条锈菌越冬的首要因素。因此全生育期抗病性的利用对青海小麦条锈菌防控有重要意义。本研究对44份来自青海的小麦种质资源进行全生育期及成株期抗病性鉴定，结果表明青麦1号、青春39和青麦5号等25份材料可能具有全生育期抗病性，其抗性遗传资源值得进一步研究。

小麦生产品种要有广泛而稳定的抗病遗传基础，抗病育种是一种有效的手段，抗病基因的组合可显著提高抗病水平，抗病利用周期更加持久。Yr5基因来源于六倍体小麦斯卑尔脱，国内目前已经出现对其致病的新菌系[11]；来源于土耳其普通小麦P1 178383的Yr10基因已对致病小种CYR34丧失抗性[19]，因此含有单个抗病基因的小麦品种面对流行小种有很大的选择压力。黄苗苗等[20]对223份小麦农家品种抗病性鉴定结果显示，白麦和六十黄同时携带有抗病基因Yr5、Yr15、Yr18和Yr26，其中白麦连续两年表现高抗。本研究发现，有8份供试材料可能携带有2个抗病性基因, 其中08-10-8可能携带Yr5和Yr24基因，13-16可能携带Yr9和Yr10基因，稷麦8号和2018153可能携带Yr9和Yr24基因，YZ813可能携带Yr9和Yr44基因，互紫麦1号可能携带Yr15和Yr24基因，19399-11和04-1可能携带Yr24和Yr44基因；有2份材料可能携带3个抗性基因，其中Hxhm18-3可能携带Yr5、Yr24和Yr44基因，40-12-86可能携带Yr10、Yr24和Yr44基因；2份材料可能携带有4个抗性基因，其中GY363可能携带Yr5、Yr9、Yr15和Yr24基因，15-34-3可能携带Yr5、Yr9、Yr24和Yr44基因。Hxhm18-3、40-12-86、15-34-3和GY363 4个品种中，除了40-12-86田间表现中感外，其余均表现高抗，需进一步研究和利用。李峰奇等[21]对14份抗CYR32的小麦农家品种进行抗病基因检测，发现有3份小麦品种含有未知的抗条锈病基因。王吐虹等[22]在40份小麦农家品种中发现有19份品种可能携带有未知的抗病基因，这表明小麦农家品种含有较丰富的遗传抗性基因资源，可作为抗病资源用于育种。本研究中航远L621未检测到所检测的6个抗病基因，但其在田间成株期表现高抗，推测可能携带有除所检测的6个抗病基因之外的其他已知或新的抗条锈病基因，有待进一步研究。

Yr9抗病基因来源于小麦-黑麦1BL/1RS易位系[23]，该易位系同时还携带有对叶锈、秆锈和白粉病的抗病基因Lr26、Sr31和Pm8，在生产上应用广泛[24]。张小娟等[25]对95份青海省小麦种质资源进行抗病基因分子检测，结果显示Yr9的检出率为17%；袁飞敏等[26]对青藏高原197份小麦品种(系)及种质资源进行抗病基因分子检测，结果显示含Yr9基因的品种占总数的16.7%；王欣等[27]对青海省育成和引进的137份小麦品种进行抗病基因分子检测，结果表明Yr9的检出率为16.1%，高于大多数其他检测抗病基因。本研究中含有Yr9基因的小麦品种有11份，占总数的25.0%，云繁105、YZ215、15-44-3和YZ361 4份品种只携带有Yr9，其中云繁105、YZ215和YZ361在成株期表现高感，所以对于含有Yr9基因的小麦品种在今后的育种中要减少使用。

本研究对青海省44份主栽与后备小麦种质资源进行抗病性评价和抗病基因分布情况分析，发现全生育期抗条锈病材料25份，总体抗条锈性水平较高。这与赵旭阳等[28]对青藏春冬麦区93份地方小麦品种抗病性评价结果相差较大，可能是本研究所用小麦品种大部分为近年青海省拟选用的后备品系。鉴于此，为了提高青海省小麦的抗病性水平，要进一步加大抗病小麦种质资源的推广力度和利用。