施磷深度对低温胁迫苜蓿根颈糖类物质含量及抗寒性的影响

夏全超，张玉霞，孙明雪，张庆昕，杜晓艳，王显国，王东儒

(1 内蒙古民族大学 农学院/内蒙古自治区饲用作物工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028041；2 中国农业大学 草业科学与技术学院，北京 028000；3 呼和浩特市农牧技术推广中心，内蒙古 呼和浩特010000)

随着我国畜牧业的发展，苜蓿(MedicagosativaL.)因具有适口性好、产量高、营养丰富、适应能力强等优点，已成为发展草牧业的首选牧草[1]。我国内蒙古科尔沁沙地是近年来发展起来的新型现代化草业生产区，优质牧草种植面积已超过4.933万hm2，但是科尔沁地区冬季寒冷少雪，且极易出现极端低温和倒春寒的现象，因此低温成为该地区苜蓿越冬的主要限制因素[2]。磷素在植物生长发育和营养物质积累中占有极其重要的地位[3]，其既参与肌醇六磷酸、核酸、核蛋白及磷脂的形成，又是多种酶的主要构成成分和底物，也是细胞核和细胞质的主要成分之一[4]。由磷脂所构成的植物细胞膜，在植物抗寒方面有极其重要的作用，磷脂亲水头部或疏水尾部能与蛋白、糖类等物质相互作用，以抵抗低温引起的脱水，维持生物膜的稳定性[5]。此外土壤磷素水平还会影响植物碳代谢，而可溶性糖、淀粉及蔗糖作为含碳化合物，均对植物的生长发育有重要作用[6]。目前，我国有近70%的农田土壤处于磷素亏缺状态[7]，且磷肥施入土壤后，极易在转化为磷酸盐后迅速被土壤矿物质吸附固定或被微生物固持，使其在当季不能被长期利用或利用率较低，并造成资源浪费和环境污染[8]。韩建国等[9]认为，由于磷肥在土壤中移动性差，因此在磷肥的施用方式中，沟施比撒施好，可使磷的固定量降低，以供给草木樨更多的未被固定的磷。姜宗庆等[10]研究表明，适宜磷素可增加小麦不同生长时期的淀粉含量及小麦叶片的蔗糖含量；闫恒辉[11]的研究表明，施磷可提高冬小麦花后0～40 cm土层的根系活力；王天等[12]研究表明，在低温胁迫下，增施磷肥可有效提高油橄榄的生理活性，缓解低温对油橄榄幼苗的损伤，进而增强植株的抗寒性；沈祥军等[13]的研究也表明，施用磷肥可以增加苜蓿根颈中可溶性糖等抗寒性物质的含量，而可溶性糖能降低细胞质的结冰点，增强植物抗寒性[14]。由此可知，前人在磷肥对作物生理特性的影响方面已有深入研究，但对于磷肥施用深度对低温胁迫苜蓿糖类物质及抗寒性影响的研究尚较为少见。为此，本研究针对苜蓿栽培生产中磷素与苜蓿根系空间与分布匹配性差的问题，探讨不同施磷深度对低温胁迫苜蓿根颈活力和糖类物质含量的影响，旨在为苜蓿抗寒高产栽培中磷肥的高效管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市开鲁县东风镇林辉草业公司基地(43°60′N，121°31′E)，该地区属于温带大陆性半干旱气候，四季分明，夏季炎热多雨，冬季干旱少雪，≥10 ℃年积温为3 000～3 200 ℃，年平均气温5.8 ℃，无霜期140～150 d，年平均降水量约370 mm，年平均风速3.1～4.3 m/s。土壤有机质含量64.10 mg/kg，碱解氮含量35.88 mg/kg，全氮含量44.01 mg/kg，速效磷含量3.59 mg/kg，速效钾含量77.89 mg/kg。

1.2 试验方法

1.2.1 大田试验设计 供试材料为‘北极熊’紫花苜蓿品种(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百斯特有限公司提供。该品种的秋眠级为2.0级，幼苗强壮、根系发达、多叶率高，是抗寒性能非常突出的苜蓿品种。

本研究采用大田试验，采用随机区组设计，于2020年7月1日播种，播种量为22.5 kg/hm2，行距为20 cm，小区面积为15 m2(3 m×5 m)。当磷肥(P2O5)施用量为225 kg/hm2时，设置施于地表及距离地表7.5，15.0，22.5，30.0 cm共5个磷肥施用深度处理，分别以S0、S1、S2、S3、S4表示，以不施磷肥为对照(CK)，每个处理均施用钾肥，钾肥(K2O)用量为150 kg/hm2。每处理设置3次重复，共18个小区。磷肥、钾肥分别为过磷酸钙(P2O5含量为44%)和氯化钾(K2O含量为60%)，均作为种肥于播种时一次性施入，施肥方式为开沟条施。试验田灌水使用指针式喷灌，并正常进行田间管理。于封冻前期(11月15日)在每个小区挖取长势一致的苜蓿越冬器官即根颈，带回室内进行低温胁迫处理。

1.2.2 低温胁迫处理 参照朱爱民等[15]的试验方法，每个小区取60株长势均匀一致的苜蓿根颈，平均分成4份，其中1份放入4 ℃冰箱中储存(低温冷藏)，将另外3份苜蓿用蒸馏水冲洗干净，整齐排放在20 cm×30 cm的脱脂纯棉布上，包裹好后用3 mL蒸馏水均匀喷洒，使棉布保持湿润，最后用30 cm×30 cm的锡箔纸包裹，放入可程式恒温恒湿试验箱分别进行-10，-20和-30 ℃的低温处理(低温冷冻)。可程式恒温恒湿试验箱设置为：以4 ℃为起点，先以4 ℃/h 的速率降温，在目标温度下保持6 h，然后以4 ℃/h的速度升温至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，与冷藏处理材料同时测定根颈活力和可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量。

1.3 测定指标及方法

根颈活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[16]测定，可溶性糖和淀粉含量均采用蒽酮比色法[16]测定，蔗糖和果糖含量分别采用二硝基水杨酸法和间苯二酚法[17]测定。

1.4 数据处理

试验数据采用WPS 2019软件进行整理并绘制图表，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用Duncan’s检验方法的新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 磷肥施用深度对苜蓿根颈活力的影响

由表1可见，在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理的苜蓿根颈活力总体上均高于CK。在4和-10 ℃低温胁迫下，S0、S1、S2和S3处理苜蓿的根颈活力均显著高于CK和S4处理(P<0.05)；在-30 ℃低温胁迫下，S0、S1、S2处理苜蓿的根颈活力均显著高于CK、S3和S4处理(P<0.05)；在-20 ℃条件下，只有S2处理苜蓿的根颈活力显著高于CK，其余处理与CK之间均无显著差异。在4，-10，-20，-30 ℃条件下，S2处理的苜蓿根颈活力总体均高于其他处理，较CK显著增加了83.43%，48.91%，57.78%和181.58%(P<0.05)，说明S2处理最有利于提高苜蓿的根颈活力。在同一磷肥施用深度处理下，苜蓿根颈活力随着温度的降低而下降，且不同低温胁迫处理间的苜蓿根颈活力均有显著性差异(P<0.05)，其中-30 ℃处理苜蓿的根颈活力最小，说明胁迫温度越低，苜蓿根颈细胞受损越严重，苜蓿根颈活力越低。

表1 磷肥施用深度对低温胁迫处理苜蓿根颈活力的影响Table 1 Effect of phosphate fertilizer application depth on root crown vigor of alfalfa under low temperature stress

2.2 磷肥施用深度对苜蓿根颈可溶性糖含量的影响

由表2可以看出，在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理苜蓿根颈的可溶性糖含量均明显高于CK。在4和-10 ℃低温条件下，S1、S2处理苜蓿根颈的可溶性糖含量均显著高于CK和S4处理(P<0.05)；在-20和-30 ℃条件下，不同磷肥施用深度处理苜蓿根颈可溶性糖含量均显著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20和-30 ℃条件下，S2处理的可溶性糖含量总体较高，较CK分别显著增加了25.81%，30.96%，39.43%和123.84%，说明S2处理对苜蓿根颈可溶性糖含量有明显的提高效果。在同一磷肥施用深度处理下，不同低温胁迫处理苜蓿根颈可溶性糖含量几乎均有显著差异(P<0.05)，其中以-20 ℃低温条件下最大，4 ℃下最小。与4 ℃处理相比，-20 ℃条件下S0、S1、S2、S3、S4处理苜蓿的根颈可溶性糖含量分别增加了140.63%，140.32%，172.37%，178.62%和161.56%，说明适当的低温胁迫可以促进苜蓿根颈可溶性糖含量的增长。

表2 磷肥施用深度对低温胁迫处理苜蓿根颈可溶性糖含量的影响Table 2 Effect of phosphate fertilizer application depth on soluble sugar content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.3 磷肥施用深度对苜蓿根颈果糖含量的影响

由表3可知，在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理苜蓿根颈的果糖含量均明显高于CK。在4 ℃低温条件下，S1和S2处理苜蓿根颈的果糖含量显著高于CK、S3和S4处理(P<0.05)；在-10，-20和-30 ℃条件下，各施磷深度处理的苜蓿根颈果糖含量均显著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20，-30 ℃条件下，S1和S2处理苜蓿根颈的果糖含量整体均高于其他处理，且较CK分别显著增加43.66%，22.31%，19.96%，48.44%和36.18%，40.73%，30.53%，61.51%，说明S1和S2处理有利于提高苜蓿根颈中的果糖含量。在同一磷肥施用深度处理下，不同低温胁迫处理间苜蓿根颈果糖含量均有显著差异，其中苜蓿根颈果糖含量在-20 ℃下最大，4 ℃下最小。与4 ℃处理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4处理的果糖含量分别增长了233.02%，174.08%，214.61%，251.97%和241.10%，说明适当的低温胁迫可以增加苜蓿根颈中的果糖含量。

表3 磷肥施用深度对低温胁迫处理苜蓿根颈果糖含量的影响Table 3 Effect of phosphate fertilizer application depth on fructose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.4 磷肥施用深度对苜蓿根颈蔗糖含量的影响

由表4可知，在同一低温胁迫处理下，除了S4处理，其他磷肥施用深度处理苜蓿根颈的蔗糖含量均显著高于CK(P<0.05)。在4 ℃低温条件下，不同磷肥施用深度处理中以S3处理苜蓿根颈的蔗糖含量最大，较CK增长了84.62%；在-10和-20 ℃下，以S2处理苜蓿根颈的蔗糖含量最大，较CK分别增长了38.55%和41.12%；在-30 ℃下，S1处理苜蓿根颈的蔗糖含量最大，较CK增长了42.49%。以上结果说明，施用适宜深度的磷肥能提高苜蓿根颈的蔗糖含量。在同一磷肥施用深度处理下，苜蓿根颈蔗糖含量均以-20 ℃下最大，4 ℃下最小，且均与其他低温胁迫处理间存在显著差异(P<0.05)。与4 ℃处理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4处理苜蓿根颈的蔗糖含量分别增长了322.76%，262.70%，247.91%，220.71%和252.06%，说明适当的低温胁迫能促使苜蓿根颈蔗糖含量的增加。

表4 磷肥施用深度对低温胁迫处理苜蓿根颈蔗糖含量的影响Table 4 Effect of phosphate fertilizer application depth on sucrose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.5 磷肥施用深度对苜蓿根颈淀粉含量的影响

由表5可见，在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理的苜蓿根颈淀粉含量均高于CK。在4 ℃下，不同磷肥施用深度处理中，S1处理苜蓿根颈淀粉含量最大，较CK增长了56.48%；在-10和-30 ℃下，S2处理苜蓿根颈淀粉含量均最大，较CK分别增长了67.23%和66.13%；在-20 ℃下，S3处理苜蓿根颈淀粉含量最大，较CK增长了147.17%，说明在不同低温条件下，适宜深度施用磷肥均能有效提高苜蓿根颈的淀粉含量。在同一磷肥施用深度处理下，不同低温胁迫处理之间苜蓿根颈淀粉含量总体均存在显著性差异(P<0.05)，其中以-20 ℃处理苜蓿根颈的淀粉含量最小，4 ℃处理的淀粉含量最大。与4 ℃处理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4处理苜蓿根颈的淀粉含量分别降低了75.74%，74.78%，65.18%，52.08%和74.38%。

表5 磷肥施用深度对低温胁迫处理苜蓿根颈淀粉含量的影响Table 5 Effect of phosphate fertilizer application depth on starch content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.6 苜蓿根颈活力与糖类物质含量的相关性分析

表6显示，在4 ℃下，苜蓿根颈活力与可溶性糖、蔗糖、淀粉含量呈显著或极显著正相关；在-10 ℃下，苜蓿根颈活力与可溶性糖、蔗糖、果糖、淀粉含量呈显著或极显著正相关；在-20 ℃下，苜蓿根颈活力与可溶性糖和蔗糖含量呈显著或极显著正相关；在-30 ℃下，苜蓿根颈活力与蔗糖、果糖含量呈显著正相关。在4 ℃下，苜蓿根颈可溶性糖含量与蔗糖、淀粉含量呈极显著正相关(P<0.01)；在-10，-20 ℃下，苜蓿根颈可溶性糖含量与蔗糖、果糖、淀粉含量呈显著或极显著正相关；在-30 ℃下，苜蓿根颈可溶性糖含量与蔗糖、果糖含量呈显著或极显著正相关。在4，-10 ℃下，苜蓿根颈蔗糖含量与淀粉含量呈显著或极显著正相关；在-20和-30 ℃下，苜蓿根颈蔗糖含量与果糖和淀粉含量呈显著或极显著正相关。在-20，-30 ℃下，苜蓿根颈果糖含量与淀粉含量呈显著或极显著正相关。以上结果说明，苜蓿根颈中的可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉含量越高，苜蓿渗透调节能力越强，生物膜结构越稳定，根颈活力越高，苜蓿抗寒能力越强。

表6 苜蓿根颈活力与其糖类物质含量的相关性 Table 6 Correlations between alfalfa root crown vitality and carbohydrate contents

表6(续) Continued table 6

3 讨 论

有研究表明，植物根系是最先感受逆境的植物器官，根颈活力常被用以衡量作物生理活性的强弱[18]。本研究结果表明，在同一磷肥施用深度处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈活力均持续降低，这是由于随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈细胞膜受损程度逐渐加重，细胞液外渗更多，正常的生命活动遭到破坏，导致根颈活力降低。吴立群等[19]的研究表明，与对照相比，低温处理水稻幼苗的根系活力均有所下降，与本研究结果一致。温斐斐[20]的研究表明，深施磷肥可提高旱地小麦各生育期的根系活力；杨春收[21]的研究也表明，磷肥施于距离地表15 cm处时能显著增加玉米的根系活力。而本研究结果表明，同一低温胁迫处理下随着磷肥施用深度的增加，苜蓿根颈活力均表现为先升高后降低的变化趋势，其中S2处理，即磷肥施用深度为15.0 cm时的根颈活力总体高于其他处理，说明在距离地表15.0 cm处施用磷肥，最有利于苜蓿根颈活力的提高。

可溶性糖是植物体内碳素营养的主要部分，不仅是细胞壁、纤维素、核酸等物质的组成成分，还能为植物体内各种生命活动提供能量，此外还直接参与调节细胞的渗透压，其含量的多少还对淀粉的积累有重要意义[22]。本研究结果表明，在同一磷肥施用深度处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈可溶性糖含量均表现为先升高后降低的变化趋势，且在-20 ℃下达到最大值；在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理苜蓿根颈可溶性糖含量均明显高于CK，这与杜旭等[23]的研究结果一致。本研究中，在同一低温胁迫处理下，S2处理苜蓿根颈的可溶性糖含量总体较高，说明在距离地表15.0 cm处施用磷肥时，可溶性糖含量的积累效果最明显。

蔗糖和果糖是植物体内能调节细胞渗透势、降低细胞冰点、稳定酶和蛋白构象的含碳化合物。有研究表明，蔗糖与果糖是提高苜蓿越冬的抗寒性保护物质[24]。本研究结果表明，在同一磷肥施用深度处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈果糖、蔗糖含量均表现为先升高后降低的变化趋势，且-10，-20和-30 ℃处理苜蓿根颈的果糖、蔗糖含量均显著高于4 ℃处理。董文科等[25]的研究结果表明，低温胁迫可导致青海扁茎早熟禾果糖、蔗糖含量上升，与本研究结果一致。本研究结果还表明，在同一低温胁迫处理下，随着磷肥施用深度的增加，苜蓿根颈蔗糖和果糖含量表现为先升高后降低的趋势，且总体上均高于CK，这可能是因为磷素是辅酶Ⅰ(NAD)、辅酶Ⅱ(NADP)等多种化合物的组成成分，这些化合物在碳水化合物的合成等生理过程中有重要作用，果糖和蔗糖作为植物体内重要的含碳化合物，受到了磷素的显著影响[26]。

植物受到低温胁迫后，水解酶活性增强，导致淀粉水解为蔗糖、可溶性糖等具有调节细胞渗透势、降低结冰点能力的物质[27]。孙明雪等[28]的研究表明，随着胁迫温度的降低，黄花苜蓿和4个紫花苜蓿品种根颈中的淀粉含量呈降低趋势。本研究结果表明，在同一磷肥施用深度处理下，苜蓿根颈淀粉含量随着胁迫温度的降低呈先降低后升高的趋势，-30 ℃下苜蓿根颈淀粉含量较-20 ℃提高的原因，可能是由于-30 ℃时淀粉水解酶活性减弱，淀粉水解过程受到抑制，进而导致淀粉含量提高。本研究结果还表明，在同一低温胁迫处理下，随着磷肥施用深度的增加，苜蓿根颈淀粉含量均表现为先升高后降低的趋势，其中S2处理的淀粉含量总体较高，说明距离地表15.0 cm处施用磷肥，最有利于苜蓿根颈中淀粉的积累。

4 结 论

在同一磷肥施用深度处理下，随着胁迫温度的降低，苜蓿根颈活力持续减弱；苜蓿根颈可溶性糖、果糖、蔗糖含量均呈先升高后降低的变化趋势，且均以-20 ℃下最大；淀粉含量呈先降低后升高的趋势，在-20 ℃下最小。在同一低温胁迫处理下，不同磷肥施用深度处理苜蓿的根颈活力及根颈可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量均高于CK，其中以磷肥施用深度为15.0 cm时总体较高。因此建议在科尔沁沙地建植苜蓿时，磷肥施用在距离土壤表面15.0 cm处，这有利于促进苜蓿糖类物质含量的增长及根系活力的增强，进而提高苜蓿的抗寒性。