薄壳山核桃根际土壤微生物群落结构特征分析

刘丽丽 李建辉 刘汝明 陈 骏 郑雪良 杨海英 王登亮 孙建城

（1衢州市农业林业科学研究院果树研究所，浙江衢州 324000；2衢州学院化学与材料工程学院，浙江衢州 324000；3衢州市柯城区林业技术推广中心，浙江衢州 324000）

薄壳山核桃（Carya illinoensis）为胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya）特色坚果和木本油料树种，别名薄皮山核桃、碧根果、长山核桃、美国山核桃，原产地为美国密西西比河流域[1-2]。薄壳山核桃种仁不饱和脂肪酸含量较高，具有降低胆固醇等保健作用[3]，同时还富含脂肪、蛋白质、VE、氨基酸及多种微量元素，食味香醇可口，含油率最高可达80%。因此，薄壳山核桃营养价值和经济价值较高，行业发展前景广阔。

根际微生物作为土壤与植物相互作用的重要媒介，其生长受到土壤和植物的双重作用与影响。植物根系通过向根际释放各种分泌物，吸引各类微生物在根际定殖，并影响其群落结构与生态功能[4]，而根际微生物则通过调节有机质的分解和提高土壤肥力在植物养分获取中发挥着关键作用[5-6]。因此，根际土壤微生物受植物种类、环境条件、土壤理化性质等多种因素的影响，不同植物种类对根际土壤微生物群落结构存在显著影响，而同类植物在不同生态环境中的根际土壤微生物群落结构也不同[7]。对于薄壳山核桃而言，了解其根际土壤微生物群落结构特征有助于揭示根系对根际环境的影响机制，但相关研究鲜见报道。

本文以浙江省衢州市引种的薄壳山核桃为研究对象，基于Illumina MiSeq高通量测序技术，对薄壳山核桃根际与非根际土壤微生物群落结构进行研究，探讨两者之间的区别，揭示其根际效应，以期为薄壳山核桃在衢州地区的引种推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

薄壳山核桃根际与非根际土壤样品采集于衢州市农业林业科学研究院果树研究所试验基地，引进的品种为波尼。选择建园3年、栽培管理措施相同、长势基本一致的3株薄壳山核桃，每株在树冠滴水线处随机选取3个取样点取样并混合后用于分析。采用内径10 cm土钻采集0～20 cm土层的样品，收集直径为1～5 mm的细根，用抖动法过孔径为1 mm土壤筛获取根际土壤样品。同时，在同一地块中未种植薄壳山核桃植株的空地上，采用“Z”形方法随机采集3份非根际土壤。将土壤样品装入已消毒的密封塑料袋中带回实验室，置于-70℃冰箱中保存备用。

1.2 基因组DNA提取和测序

采用土壤微生物DNA提取试剂盒提取薄壳山核桃根际与非根际土壤样品基因组总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳并利用核酸定量分光光度计进行检测，结果如表1所示。由杭州沃森生物公司通过Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。细菌扩增引物为 B341F（5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′）和B785R（5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），真菌扩增引物为 ITS-3（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和 ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）。

表1 土壤微生物基因组DNA检测结果

1.3 数据处理与分析

采用DPS统计软件进行数据处理与分析，利用Duncan新复极差法（LSR）进行差异显著性检验。在97%相似水平上对可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）进行分类分析，并在不同分类水平上统计种类组成。采用ACE指数、Chao1指数和Shannon指数、Simpson指数计算微生物多样性[8-9]。使用Blast在 NCBI数据库（https：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）进行比对，将优化序列根据数据库中的参考序列在门、纲、目、科、属水平上进行鉴定，比较分析其种类组成和丰度。

2 结果与分析

2.1 薄壳山核桃根际与非根际土壤微生物测序结果和数量分析

通过Illumina MiSeq高通量测序获得了薄壳山核桃根际与非根际土壤细菌和真菌群落的优化序列及其OTUs的信息。双端序列（reads）拼接和过滤后，共得到薄壳山核桃根际与非根际土壤细菌序列数分别为23 786条和25 653条，非根际土壤细菌序列数比根际多1 867条；根际与非根际土壤真菌序列数分别为28 858条和40 021条，非根际土壤真菌序列数比根际多11 163条。

从表2和表3可以看出：细菌共获得3 690个用于物种分类的OTUs，根际和非根际OTUs数量分别为 1 882个和 1 808个，两者差异不显著（P＞0.05）；真菌共获得877个用于物种分类的OTUs，根际和非根际OTUs数量分别为305个和572个，两者差异显著（P＜0.05）。薄壳山核桃根际土壤中细菌的OTUs数量与非根际土壤相近，但真菌的OTUs数量显著少于非根际土壤（P＜0.05），表明种植薄壳山核桃后，根际土壤中细菌的物种数量变化不大，但真菌的物种数量受到显著影响。

表2 薄壳山核桃根际与非根际土壤细菌多样性指数

表3 薄壳山核桃根际与非根际土壤真菌多样性指数

2.2 薄壳山核桃根际与非根际土壤细菌多样性

2.2.1 细菌种类组成。薄壳山核桃根际与非根际土壤中细菌相对丰度排名前3位的门分别为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria），其中放线菌门在根际与非根际土壤中的相对丰度均达到25%以上。在纲分类水平上，薄壳山核桃根际与非根际土壤中均以放线菌纲（Actinobacteria）的相对丰度最高，根际为22.92%，非根际为28.76%。从目分类水平来看，薄壳山核桃非根际土壤中以放线菌目（Actinomycetales）相对丰度最高，根际土壤中以其他目相对丰度最高。

2.2.2 细菌多样性。从表2可以看出，根际和非根际土壤中细菌测序覆盖率均达97%以上，表明两者的测序结果都可以反映其真实情况。在生物多样性指标中，Shannon指数、Chao1指数和ACE指数的数值越大，被测样品多样性越高；Simpson指数值越小，生物多样性越高。从表2可以看出，根际和非根际土壤样品的Chao1指数和ACE指数值都比较大，表明两者的细菌丰富度都比较高，但两者之间的差异未达到显著水平；根际与非根际土壤Simpson指数较为接近，根际土壤的Shannon指数略高于非根际，但两者差异不显著。由此可知，薄壳山核桃根际与非根际土壤中细菌丰富度总体较高，但两者差异不显著。

2.3 薄壳山核桃根际与非根际土壤真菌多样性

2.3.1 真菌种类组成。薄壳山核桃根际与非根际土壤中真菌相对丰度均以子囊菌门（Ascomycota）最高，其中根际土壤中真菌相对丰度达82.97%，非根际土壤中真菌相对丰度达86.96%。在纲分类水平上，薄壳山核桃根际土壤中真菌以散囊菌纲（Eurotiomycetes）相对丰度最高，为 70.59%；非根际土壤中真菌以子囊菌门中未分类的纲相对丰度最高，为44.02%。从目分类水平来看，薄壳山核桃根际土壤中真菌以散囊菌目（Eurotiales）相对丰度最高，为68.95%；非根际土壤中真菌以子囊菌门中未分类的目相对丰度最高，为44.02%。

2.3.2 真菌多样性。从表3可以看出，根际土壤和非根际土壤中真菌测序覆盖率均达到99%以上，表明两者的测序结果都可以反映其真实情况。从各项多样性指数来看，Chao1指数、ACE指数以及Shannon指数均为非根际土壤大于根际土壤，且差异显著，表明非根际土壤中真菌多样性显著大于根际土壤（P＜0.05）；Simpson指数表现为非根际土壤显著小于根际土壤（P＜0.05）。由此可见，薄壳山核桃根际与非根际土壤中真菌多样性存在显著差异，根际土壤真菌多样性小于非根际土壤。

3 结论与讨论

根际土壤微生物群落在植物生长、发育、营养和病理等方面都扮演着重要角色[10]。本研究通过Illumina MiSeq高通量测序平台对薄壳山核桃根际与非根际土壤进行了宏基因测序，获得细菌和真菌序列。结果发现，薄壳山核桃非根际土壤中细菌和真菌序列数分别比根际土壤多1 867条和11 163条，根际与非根际土壤中细菌的OTUs数量差异不显著，非根际土壤中真菌的OTUs数量显著大于根际土壤。从细菌和真菌组成来看，薄壳山核桃根际与非根际土壤中相对丰度最高的细菌为放线菌门、真菌为子囊菌门。从已有研究来看，放线菌能提高土壤抑病能力，子囊菌门的某些微生物能够改善植物的抗菌、抗氧化作用，可以增加植物的生物量，提高植株的抗病性，促进植株生长[11]。由此可见，薄壳山核桃根际土壤中存在一些能抑制病原菌生长的微生物，可增强其对环境胁迫的耐受能力，这在其他研究中也有类似报道[12-13]。

从本研究采用的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数来看，薄壳山核桃非根际土壤中的真菌多样性高于根际土壤，但细菌差异不显著，这可能与薄壳山核桃根系分泌物有关。在植物生长过程中，根系分泌物影响根际微生物的种类组成，是促进植物根际形成不同微生态环境的重要因素[14]。黄玉茜等[15]研究发现，花生（Arachis hypogaea）根系分泌物可以改变土壤中微生物群落的组成与多样性。刘纯等[16]研究发现，假高粱（Pseudosorghum zollingeri）根系分泌物对部分微生物有明显的促进作用，对部分微生物有显著的抑制作用。本研究发现，薄壳山核桃根系分泌物对根际土壤中不同微生物的影响效应各不相同，其对真菌具有显著的抑制作用，但对细菌的作用并不明显，表明其对根际土壤微生物的影响作用具有一定的选择性。