13 味归肺经中药UPLC 指纹图谱特征及“印迹模板”成分簇划分的研究

欧阳少琴,陈宇霞,黄晨存,杨学斌,李 萍,贺福元，3，4，5*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208；2.中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学中药炮制与制剂制备工程技术实验室，湖南 长沙410208；4.湖南中医药大学中医药超分子机理与数理特征化实验室，湖南 长沙410208；5.中药药性与药效国家中医药管理局重点实验室，湖南 长沙410208）

中药归经理论是中药药性理论的重要组成部分，历代中医学家用其指导临床遣方用药，提高疗效[1]。 其理论萌芽于先秦，形成于秦汉，成熟于宋元，直到金元时期易水学派的开山祖师张元素，在临床经验的基础上，对脏腑辨证和药物配方进行了详细总结研究，才提出“药物归经”和引经之说[2]。 中药归经是临床上用来标明药物的作用部位，归是走向、归属的涵义，有定向、定位的概念；经包括经络，也包括脏腑及脏腑病变证候群；二者共同表示出药物对人体特定部位有识别的选择性作用[3]。 因此，中药归经理论用现代科学语言表征就是生物超分子“印迹模板”选择性作用规律[4]。

超分子“印迹模板”[5-6]是主客分子间有效作用原子基团点阵的空域，体现出自识别、自组装、自组织和自复制的分子间自律作用规律，据此，本团队前期创立了中医药超分子“气析”理论[7]，用于破解中医药理论现代化面临的3 个重大前沿科学问题。 作为超分子“印迹模板”客体物质的中药，进入人体后，能发挥识别、组装、组织等一系列调节功能，从而寻找到符合超分子“印迹模板”理论的超分子主体物质，即与客体物质具有相似空间结构并在特定条件下发生相互作用，从而产生针对人体经络脏腑的特异性药效，自然宏观上表现出了中药归经现象，因此，中医药“印迹模板”“气析”理论是指导研究中药归经理论适宜的现代科学工具。

有鉴于此，本文以全国中医药行业高等教育“十三五”规划教材《中药学》为基本标准[8]，遴选出只归肺经的13 味中药，分别是白前、百部、苍耳子、芥子、金荞麦、桔梗、款冬花、马勃、前胡、桑白皮、射干、鱼腥草、紫菀，进行指纹图谱印迹性研究，根据具有相同（似）的“印迹模板”成分簇，具有相似的结构特征，作用于相似的经络脏腑，在色谱学上表现为具有相同（似）的印迹作用，其指纹图谱特征相同（似），在指纹图谱分析评价系中进行匹配就会出现以“印迹模板”成分簇为中心的指纹峰聚集现象，出现保留时间与匹配频数呈凹凸状分布，据此可用匹配频数法进行“印迹模板”成分簇划归，以确定归肺经可以存在的“印迹模板”，为后续的归肺经的物质基础研究奠定基础[9]。 在进行中药“印迹模板”研究时，可采用总量统计矩法、信息熵与信息量量化表征其印迹性，从而可定量分析归肺经成分簇总体分布特征。

1 实验方法

1.1 基本理论

1.1.1 中药指纹图谱印迹性的分析和划分方法 中药指纹图谱的分析方法较多[10]，一般关注色谱峰的含量变化，较少关注成分的印迹性变化。 由于中药成分受到原植物遗传和地域的影响，表现出成分簇和含量的随域变化，表现出成分变化与疗效变化的不对称性，因此用控制成分的种类和含量来研究中药物质基础不易成功[11-12]，为此，本团队前期创立了能表征中药成分簇印迹效果的指纹图谱分析方法：总量统计矩（相似度）法[13]。 该法包括总量零阶矩，表示总成分簇印迹量；总量一阶矩，表示总成分簇印迹度；总量二阶矩，表示总成分簇印迹度的方差；由总量一阶矩、二阶矩转变成正态概率密度函数，建立起具有统计性的相似度法。 因此，中药归肺经成分簇的“印迹模板”作用特征，即对肺经的选择性就可以用总量统计矩表征，总量统计矩参数越近，其印迹度越似，在总印迹量不变的情况下，其成分簇归肺经的可能性就越高[14]。 中药材指纹图谱上每个峰对应一个以上化学成分，中药成分复杂多样，每个化学成分可看作一个离散值，峰的强度即表明其化学信息显现的概率，其受色谱条件、药材成分相互作用等的综合反映，因此将每一成分看成一个信息元，则可用信息熵表征一张指纹图谱的信息载荷特征[15-17]，通过计算和比较信息熵能够反映指纹图谱所携带成分的信息总量的变化。 再乘以总峰面积就能转变成信息量，表征整个指纹图谱信息容量大小[18]。

另外，中药成分修饰成最接近“印迹模板”结构特征的成分的概率较大，出现的频率较高，而修饰成远离“印迹模板”结构特征的成分的概率较小，出现的频率较小，在色谱学上表现出以最接近“印迹模板”结构特征成分为中心的簇状分布特征和以指纹图谱色谱峰对保留时间的凸凹状分布，其分离度的大小表示“印迹模板”的相似程度，与匹配频数相关。 通过对指纹图谱色谱峰匹配时共同出现的频数进行统计学分析，取频数的均数与一定置信度下的统计量乘以标准差的积之和为界值确定“印迹模板”数目。

将S 个样品的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行校正、匹配和数据导出，获得总色谱峰数Sp、各色谱峰的保留时间、各样本峰面积、对照指纹图谱峰面积、保留时间RSD、峰面积RSD 和匹配数Npc，其中匹配数就是“印迹模板”成分簇对应一定保留时间共同出现色谱峰的数目，由中药色谱指纹图谱相似度评价系统给出。 可先对所纳入的指纹图谱的匹配频数进行统计分析，求算平均匹配频数和标准差，设定置信系数，按式（1）计算出划成“印迹模板”成分匹配频数的最低界值，排序取大于该界值的匹配频数的成分峰为共有“印迹模板”数，获得成分簇“印迹模板”总数目。

式中Npc为划作“印迹模板”所需最低匹配频数的色谱峰，计算大于等于Npc的色谱峰数N，即为“印迹模板”数，是匹配频数的平均值，t(α,v)的置信度为1-α，自由度ν（总匹配峰数目-1）为对应的t 界值，SD 为匹配频数的标准差。

按式（2）计算Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间。

式中tRpci为Npci、Npc(i+1)两“印迹模板”成分簇划分时的保留时间，tpci为“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，tpc（i+1）为Npc（i+1）“印迹模板”所对应匹配色谱峰的保留时间，Np,j为[Npci、Npc（i+1）]两“印迹模板”的j 成分的匹配频率，tp,j为[Npci、Npc（i+1）]两“印迹模板”的j 成分的保留时间。

对划好界的“印迹模板”成分簇按保留时间的匹配频数统计均值计算出新的保留时间，而峰面积相加得新的成分簇峰面积，由此构成归肺经成分簇“印迹模板”色谱峰表征体系。

1.2 实验材料

1.2.1 仪器 Acquity UPLC（美国Waters 公司，型号：H19CHAO89G）；旋转蒸发器（巩义市中天仪器科技有限公司，型号：RE-2000A）；循环水式多用真空泵（北京市中兴伟业仪器有限公司，型号：SHB-IIIA）；调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：DZTW）；多功能粉碎机（永康市玖蓝五金制品有限公司，型号：XY-500A）；电子天平（哈尔滨众汇衡器有限公司，型号：JCS-31002C）；数显恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂，型号：HH-4）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB-5200 DTD）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DZF-6050）。

1.2.2 试药 吐叶醇、亚麻木酚素、款冬酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：B30361、B21419、B20690）；乙腈、甲醇（美国TEDIA 公司，批号：20075279、20085005）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20181201）；无水乙醇（湖南汇虹试剂有限公司，批号：19065197）；自制纯化水。 白前、百部、苍耳子、芥子、金荞麦、桔梗、款冬花、马勃、前胡、桑白皮、射干、鱼腥草、紫菀购于湖南长沙高桥中药材市场，均由湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室石继连教授按2020 版《中华人民共和国药典》(一部)有关项下进行鉴别[19-20]，均符合规定，各药材样品均干燥粉碎后过60 目筛备用。

1.3 供试液的制备与测定

1.3.1 色谱条件及系统性适应 色谱柱为Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.4%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，两相梯度洗脱，洗脱程序：（0～5 min，0%→10%B；5～25 min，10%→15%B；25～45 min，15%→22%B；45～65 min，22%→35%B；65～80 min，35%→40%B；80～90 min，40%→60%B；90～100 min，60%→70%B；100～102 min，70%→90%B；102～105 min，90%→0%B），体积流量为1.0 mL/min，进样量为1 μL，检测波长为320 nm。经计算得出各成分理论塔板数不低于3000，说明此条件分离度良好。

1.3.2 对照品溶液的制备 分别取吐叶醇、亚麻木酚素、款冬酮对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加入甲醇定容，分别制成2.5 mg/mL 的对照品溶液，并超声处理5 min，过0.22 μm 有机滤膜进液相色谱仪样品瓶中，待测。1.3.3 供试品溶液的制备 取13 味中药白前、百部、苍耳子、芥子、金荞麦、桔梗、款冬花、马勃、前胡、桑白皮、射干、鱼腥草、紫菀，分别取20 g，磨成细粉，加入70%的乙醇回流提取两次，每次1 h，旋干成浸膏，取一定量浸膏加甲醇定容至10 mL 容量瓶，用0.22 μm 过滤器滤过，即得各药品成分提取物，浓度为0.5 g/mL（生药），取上清液过0.22 μm 有机滤膜进液相色谱仪样品瓶中，待测。

1.3.4 方法学考察 （1）精密度试验：分别取“1.3.2”项下方法制备的同一供试品溶液，按上述色谱条件进样1 μL 测定，分别重复进样6 次，记录指纹图谱，分别测得亚麻木酚素、吐叶醇、款冬酮的相对峰面积RSD 少于3%，表明实验仪器精密度良好。

（2）稳定性试验：分别取“1.3.2”项下方法制备的同一供试品溶液在2、4、6、8、12、24 h 分别进样1 μL测定，记录指纹图谱，分别测得亚麻木酚素、吐叶醇、款冬酮的相对峰面积RSD 少于3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

（3）重复性试验：分别取同一批药材，按“1.3.3”项下方法操作，分别平行制备6 份供试品溶液，分别按上述色谱条件进样1 μL 测定，记录指纹图谱，分别测得亚麻木酚素、吐叶醇、款冬酮的相对峰面积RSD 少于3%，表明该色谱条件下重复性良好。

2 实验结果

2.1 UPLC 指纹图谱的建立

取“1.3.3”项下配制的供试品溶液进样，测得白前、百部、苍耳子、芥子、金荞麦、桔梗、款冬花、马勃、前胡、桑白皮、射干、鱼腥草、紫菀13 味中药的UPLC 指纹图谱叠加图。 详见图1。

图1 13 味归肺经中药的UPLC 指纹图谱叠加图

2.2 UPLC 指纹图谱的总量统计矩及信息熵分析

按总量统计矩参数公式计算，分别得到白前、百部、苍耳子、芥子、金荞麦、桔梗、款冬花、马勃、前胡、桑白皮、射干、鱼腥草、紫菀13 味药材的峰数、总量统计矩零阶矩、一阶矩、二阶矩参数值。 详见表1。

2.3 13 味归肺经UPLC 中药指纹图谱总量统计矩相似度

根据表1 中总量统计矩一阶矩、二阶矩参数，按总量统计矩相似度公式计算13 味归肺经中药指纹图谱的相似度、平均值及RSD。 详见表2。

表1 13 味归肺经中药UPLC 指纹图的总量统计矩计参数及信息熵、信息量

2.4 13 味归肺经中药UPLC 指纹图谱“印迹模板”成分簇的划分

先将13 味中药指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统获得不同保留时间的匹配频数，见图2。 再按式（1）分别计算出13 味归肺经中药成分簇划成“印迹模板”中心成分的最少匹配频数，为7.35 个，取大于7 的匹配频数色谱峰为“印迹模板”成分簇中心成分，共确定了30 个“印迹模板”中心成分簇；再根据式（2）划分出每个“印迹模板”中心成分簇间的界线，再根据匹配频数统计法计算出新保留时间和新峰面积，其划分后生成新的指纹图谱的保留时间和峰面积，详见表3。

图2 13 味归肺经中药不同保留时间的匹配频数图

3 分析与讨论

3.1 13 味归肺经中药UPLC 指纹图谱特征分析

由图1、表1-2 可知，13 味归肺经中药的UPLC指纹图谱的峰数目相差较大，以桔梗最少，为39 个，以桑白皮最多，为113 个，平均80 个，RSD 为33.18%，说明各归肺经中药的成分种类变化较大，成分簇种数不同；总量统计矩零阶矩相差更大，以白前最少，为1960 μA·s；以前胡最大，为65 421 μA·s，两者相差近30 倍，平均为19 230.45 μA·s，RSD 为104.10%；一阶矩相差也大，以百部最少，为8.3 min，以前胡最大，为78.44 min，平均为27.21 min，RSD 为81.98%，说明各成分簇种类相差较大；二阶矩以百部最少，为33.42 min2，以白前最大，为1073.35 min2，平均为435.0 min2，RSD 为74.61%，说明各成分簇“印迹模板”类型分散。 表2 的总量统计矩的相似度也佐证了13 味归肺经中药的成分簇变化较大，其整体相似度以前胡最小，为0.286 4，以紫菀最大，为0.659 9，平均为0.546 7，RSD 为49.07%。上述的UPLC 指纹图谱成分簇总量统计矩参数表明归肺经中药成分簇种类较多，成分簇印迹性各异，各中药归肺经的成分簇类型不尽相同。

表2 归肺经13 味中药UPLC 指纹图谱的总量统计矩相似度

同时对13 味归肺经中药的信息熵进行分析，其中以芥子最小，为2.994，以金荞麦最大，为5.633，13味归肺经中药平均信息熵为4.259，RSD 为20.66%，说明各中药成分簇构成比相差大小不同。 构成比相差越大，信息熵越小，相差越小，信息熵越大。同时还与峰的数目有关，峰数越少，信息熵越小，峰数越多，信息熵越大。 因此归肺经中药成分的构成比相差也大不相同，信息量结果与零阶矩相似。

因此，通过对13 味归肺经中药指纹图谱特征及信息熵、信息量的分析，发现归肺经成分簇种类较多且分散，各中药不尽相同，其中以前胡相差最大，以上结果体现了归肺经中药成分簇的多样性。 说明归肺经中药可从细胞、组织、器官等不同层次进行进行多环节代谢，发挥肺经的“印迹模板”“气析”作用，可构成肺经作用成分簇家族系统[5]。

3.2 13 味归肺经中药成分簇“印迹模板”的划分

尽管归肺经中药成分簇多样， 但可以通过指纹图谱的印迹性进行成分簇“印迹模板”划分。根据“印迹模板”特征与色谱印迹性相一致原则，对中药指纹图谱相似度分析系统中的成分簇匹配频数进行划分，如图2。 由图可知13 味中药匹配频数较高者均集中在色谱峰的前端12 min 以内，而后面的匹配频数偏低，取置信系数为0.05，求算概率大于95%的匹配频数最低值为7.35，取匹配数为7 以上成分簇作为“印迹模板”中心成分来划分成分簇，共得到30个归肺经“印迹模板”成分簇，由表3 可知，各“印迹模板”成分簇的RSD 都非常大，以6 号峰最少，为79.70%，以24 号峰最大，为344.9%，大小相差悬殊。总量统计矩法是运用数学统计思维从整体方面计算，不采用传统的化学分析模式，即单个特征峰一一对比，只考虑中药材化学成分簇“印迹模板”差异，根据相同（似）的“印迹模板”，具有相同（似）的相色谱印迹行为，具有相同（似）的保留时间，具有相同（似）的药效属性，具有相同（似）的中药归经属性的原则进行分析，因此总量统计矩是较宜用来研究中药成分簇归经属性的方法，再结合信息熵的越小成分簇就越集中的原则，选择总量统计矩相似度大、中、小而信息熵小，匹配频数高的归肺经中药进行“印迹模板”特征研究可获得归肺经中药的突破。因此，13 味中药中以前胡的相似度最低，信息熵也较低；桔梗的成分数目少，信息熵也较低，同时相似度又接近平均相似度；百部的成分数目较少，信息熵也较低，总量一阶矩最少，可作为研究归肺经物质基础良好的模型中药。 同时，金荞麦、桑白皮、射干、鱼腥草都含有黄酮成分，色谱峰较多，相似度也与平均值接近，因此可作为归肺经中药成分组模型进行研究。 从新的“印迹模板”色谱峰来看，可初步推断归肺经中药的超分子“印迹模板”主要在色谱峰的前端12 min 以前，以极性和中性物质为主，而12 min 以后为各归肺经中药特有的“印迹模板”，已将其合并为29、30两个“印迹模板”成分簇。

表3 13 味归肺经中药成分“印迹模板”划分后新UPLC 指纹图谱的保留时间和峰面积

本文是基于中医药超分子“印迹模板”的“气析”理论，运用总量统计矩分析法、信息熵理论对13 味归肺经中药指纹图谱进行解析，对整个指纹图谱成分簇种类、含量及构成比进行比较，初步分析了归肺经中药的“印迹模板”成分簇特征，为后续的HPLC/MS 分析和经络实体荧光成像研究奠定了基础，也为中药归经和经络物质基础研究提供一种基础研究方法。