固肠止泻丸对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用研究

吴冬芝，吴柯楠，程 雯，李雯瑞，王 婷，梁艳妮*，王 征*

（陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西 咸阳 712083）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是消化系统常见疾病，病情反复发作、病因迄今不明[1]。 其病理特征常始自左半结肠，后蔓延至整个结肠，同时引发消化道梗阻、穿孔、中毒性结肠扩张、直乙状结肠癌变等并发症，临床表现多为溃疡、出血和电解质代谢紊乱等[2]。 调查显示，我国UC 发病率约为11.6/10万[3]。 同时，作为治疗周期长，对患者造成身心双重折磨的全球性疾病，UC 受到了广泛关注。

固肠止泻丸（Guchang Zhixie Wan, GC）属于国家中药保护品种，方中乌梅味涩，为君药；罂粟壳酸涩，既可助君药涩肠，又兼止痛；黄连与干姜共奏寒热并用之法，三药相伍，温散并行；延胡索、木香辛温，活血消痛。诸药共奏寒热并用、标本兼治、调和肝脾、涩肠止痛之功[4]。 本课题组前期研究[5]发现，GC对葡聚糖硫酸钠（destran sulfate sodium, DSS）诱导的UC 小鼠肠道菌群有一定的影响，结果表明GC能够明显回调UC 小鼠肠道菌群的多样性，恢复UC小鼠结肠中拟杆菌门与厚壁菌门的比例，但机制尚不清楚。本文在前期研究的基础上，建立3% DSS 诱导的UC 模型，探究GC 对DSS 诱导UC 小鼠的治疗作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级C57BL/6 雄鼠共36 只，6～8 周，体质量约20 g，购自成都达硕实验动物有限公司，饲养管理遵循《陕西省实验动物管理办法》。动物饲养于陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心SPF 级实验动物中心，室内12 h 光照和黑暗更替。 实验动物许可证号：SCXK（川）2020-030。

1.2 药物

GC（陕西中医药大学制药厂，批号：20I11062）；柳氮磺胺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司，批号：22200301）。

1.3 主要试剂

DSS（美国MP Biomedicals 公司，批号：S3045）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20210922）；小鼠白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）（欣博盛生物科技有限公司，批号：M190322-003a、M190322-004a、M190322-104a、M190322-005a、M210722-102a）；兔抗鼠单克隆抗体核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）/p65（#8242S）、核因子κB 抑制蛋白α（inhibitor alpha of NF-κB,IκBα）（#4812S）、信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3, STAT3）（#12460S）、磷酸化信号转导及转录激活因子3（phosphorylated signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）（#9145S）均购自美国Cell Signaling Technology 公司；ECL 发光液（德国默克密理博公司，批号：2106001）；HRP 标记羊抗兔IgG（批号：BA1105）、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（批号：16H17B38）均购自博士德生物有限公司。

1.4 主要仪器

万分之一天平（德国美墨尔特有限公司，型号：1730R）；GEL DocXR+伯乐凝胶成像系统（美国BIO-RAD 公司，型号：721BR11053）；全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司，型号：JXFSTPRP-64）；低温冷冻离心机（型号：75002440）、全波长酶标仪（型号：51119200）均购于美国Thermo 公司。

1.5 方法

1.5.1 实验分组及模型制备 36 只C57BL/6 雄鼠被适应性喂养7 d 后随机分为4 组。 除对照组小鼠自由饮用纯净水外，柳氮磺胺吡啶组、GC 组、模型组小鼠分别自饮3% DSS 进行UC 造模，小鼠出现体质量下降、腹泻便血等体征，疾病活动指数（disease activity index, DAI） 评分达到3 分时表示UC 建模成功[6]。

1.5.2 给药方法 依据课题组前期对GC 进行的研究[5]，GC 组选择50 mg/kg 的GC 灌胃，0.075 g 的GC研成粉末后，加纯净水至15 mL，超声溶解配制成浓度为5 mg/mL 的药液；柳氮磺胺吡啶肠溶片配制成浓度为12.5 mg/mL 的柳氮磺胺吡啶混悬液，作为实验中的阳性对照[7]。 待UC 造模成功后，模型组与对照组灌胃相应体积纯净水，其余组小鼠灌胃相应体积药液。 实验小鼠灌胃体积为0.01 mL/g，均连续灌胃观察5 d，每天灌胃1 次。

每天根据DAI 评分表[8]对小鼠体征情况进行综合评分。 对体质量下降率、大便性状、血便情况进行评分，总分4 分，分值越高代表疾病状态越严重。

1.5.3 取材 连续灌胃观察5 d 后，小鼠禁食24 h，不禁水，眼眶采血备用，剪取约1 cm 结肠组织铺于塑料片上，用4%多聚甲醛固定结肠组织[9]，石蜡块包埋，HE 染色观察小鼠结肠组织病理情况。

1.5.4 石蜡包埋和HE 染色 结肠组织样本在流水中冲洗1 h，放于逐级增加浓度的乙醇中脱水1 h，再用二甲苯透明处理，使组织的折光率增高呈透明状，脱脂后的组织放入石蜡中浸透，模具固定组织，凝固则制得包埋蜡块，冷冻15 min，最终切成5 μm的石蜡切片[10]。二甲苯充分脱蜡溶解后流水洗涤，石蜡切片在苏木素碱性染料中染色，水洗后再分化，入伊红染液中再次对其染色，最后再用乙醇脱水，浸泡于二甲苯溶液中直至透明，滴入中性树脂封固以长期保存。显微镜观察实验各组小鼠结肠组织的特征性病理变化[11]。

1.5.5 ELISA 法检测血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量 实验动物眼球摘除取血，将血液样本分离后取其上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行血清炎症因子（IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）含量测定。

1.5.6 Western blot 法检测结肠组织NF-κB、STAT3蛋白表达 取0.10～0.15 g 结肠组织，放入离心管进行制样。 加入裂解液充分匀浆，离心取上清，4 ℃冷藏。 配制BSA 浓度梯度标准液及BCA 工作液，在进行蛋白质定量分析后， 进行蛋白电泳。 电泳条件为90 V，30 min 后转120 V，然后进行转膜，封闭2 h后在4 ℃条件下孵育一抗NF-κB（1∶1000）、IκBα（1∶1000）、STAT3（1∶1000）、p-STAT3（1∶2000）过夜，用辣根过氧化酶标记的二抗与一抗在37 ℃条件下作用1 h，将PVDF 膜平铺于保鲜膜上，加入ECL 发光液避光反应2 min，最后用BIO-RAD 凝胶成像系统对PVDF 膜进行曝光处理。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 软件对实验数据进行处理，如果数据符合正态性分布和方差齐，多组间差异比较用单因素方差分析；如果非正态分布或方差不齐，多组间比较用Games-Howell 检验。P＜0.05为差异具有统计学意义，实验所得结果用“±s”表示。

2 结果

2.1 各组给药前后一般情况观察及DAI 评分比较

与对照组相比，模型组小鼠DAI 评分显著增加（P＜0.01），除对照组外，其余各组DAI 评分在前5天迅速上升，小鼠状态逐渐变差，体质量下降明显，大便不成形，个别出现血便，表明成功诱导UC 疾病模型；第5 天开始，与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和GC 组小鼠DAI 评分均下降（P＜0.01），小鼠状态好转，体质量回升，大便性状正常。 柳氮磺胺吡啶组与GC 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图1。

2.2 各组结肠组织观察

对照组隐窝结构清晰，杯状细胞排列整齐，未见炎症细胞聚集；模型组可见腺体遭受不同程度破坏，杯状细胞减少，隐窝出现异常扭曲，炎性异常浸润，病变主要集中在黏膜层，表明UC 模型构建成功；柳氮磺胺吡啶组可见结肠结构相对恢复完整，隐窝及杯状细胞较为明晰，但黏膜层仍有部分炎症细胞浸润，表明柳氮磺胺吡啶对DSS 所致的UC 有缓解作用，但无法完全消除结肠受到的破坏和伤害；GC 组可见结肠组织形态完整，隐窝表面规整，杯状细胞形态清晰，黏膜结构有所恢复，表明GC 能有效改善小鼠结肠炎症状况，恢复UC 引起的结肠组织损伤。详见图2。

2.3 各组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量比较

与对照组比较，模型组IL-6、IL-8 和TNF-α 含量升高（P＜0.01），IL-4、IL-10 含量降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，GC 组IL-6、IL-8 和TNF-α含量下降（P＜0.05，P＜0.01），IL-4 含量升高（P＜0.01）；与柳氮磺胺吡啶组比较，GC 组IL-10 表达降低（P＜0.05）、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表1。

表1 各组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量变化（±s，n=6，pg/mL）

表1 各组血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 含量变化（±s，n=6，pg/mL）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，＆P＜0.05。

IL-4 72.97±4.11 59.17±3.24**74.53±4.45##75.83±4.70##IL-10 72.02±8.25 54.32±6.95*76.18±6.96##60.29±8.37＆IL-6 77.17±2.76 100.6±6.17**75.73±2.95##78.20±2.39##IL-8 215.5±22.07 467.1±10.76**351.4±19.18##350.0±33.28#组别对照组模型组柳氮磺胺吡啶组GC 组TNF-α 82.66±2.03 91.32±3.03**77.08±2.99##75.38±2.83##

2.4 各组结肠组织NF-κB、STAT3 蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组中NF-κB 和IκBα 蛋白表达降低（P＜0.01），p-STAT3/STAT3 蛋白比值升高（P＜0.05）；与模型组比较，GC 组中的NF-κB 和IκBα蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01），柳氮磺胺吡啶组和GC 组p-STAT3/STAT3 蛋白比值降低（P＜0.05，P＜0.01）；与柳氮磺胺吡啶组比较，GC 组NF-κB 蛋白表达升高（P＜0.05）、IκBα 蛋白和p-STAT3/STAT3蛋白比值差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图3、表2。

表2 各组结肠组织NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3蛋白表达比较（±s，n=6）

表2 各组结肠组织NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3蛋白表达比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与柳氮磺胺吡啶组比较，＆P＜0.05。

组别对照组模型组柳氮磺胺吡啶组GC 组NF-κB/β-actin 1.14±0.18 0.72±0.07**0.52±0.09 0.88±0.05#＆IκBα/β-actin 0.70±0.07 0.22±0.07**0.48±0.12 0.66±0.07##p-STAT3/STAT3 0.29±0.12 0.91±0.06*0.45±0.09##0.42±0.10#

图3 各组结肠组织NF-κB、IκBα、p-STAT3 和STAT3 蛋白条带图

3 讨论

UC 属于炎性肠病的临床亚型，发生于各个年龄段，因其发病机制尚未确定而受到广泛关注[12]。临床上常用柳氮磺胺吡啶治疗UC，但长期使用容易引起各种不良反应，而中药方剂因其多样性、疗效确切、安全性高，故更适用于UC 的治疗[13-15]。 GC 是治疗UC 的经典药物之一，其成分中的乌梅收敛涩肠；黄连苦寒燥湿；干姜温中实脾，缓解黄连寒凉之性，使黄连寒而不滞[16]，协同达到行气活血、润肠止泻的功效，改善由UC 引起的寒热错杂、阴虚肠燥等证型。

本实验建立由DSS 诱导的UC 小鼠模型，评估GC 的作用效果。DAI 评分显示，GC 通过减缓小鼠体质量减轻、改善大便性状等临床表现，恢复UC 对小鼠体征的影响；病理学组织切片结果表明，GC 能保护肠黏膜、减少炎症细胞的浸润、减轻腺体紊乱、改善肠道内炎症。炎症的发生多是由于炎症因子的失衡导致[17]，因此，调节促炎因子和抑炎因子水平的平衡是治疗炎症的关键指标之一，本研究结果显示GC 可下调IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，并上调抑炎因子IL-4 和IL-10 的表达，说明GC 可在一定程度上调节炎症因子的表达，改善促炎因子和抑炎因子的失衡。

本课题组前期已研究GC 对DSS 诱导的UC 小鼠的影响，结果显示，GC 调节UC 小鼠肠道内炎症细胞因子和肠道细菌丰度，进而改善UC 的病理表现[5]。既往研究表明，STAT3 和NF-κB 信号通路在UC的发展过程中起关键作用[18-19]。 STAT3 和NF-κB 的激活和串扰，促使炎症因子产生和释放，可导致慢性炎症和肿瘤的发生。 NF-κB 在细胞静息状态下与抑制性蛋白IκB（IκBα）稳定结合在细胞质中，当胞外信号传递至胞内，在激酶IKK 组成的复合物作用下，IκBα 被磷酸化降解，NF-κB 亚基进入核内，诱发炎症[20-21]。 研究表明，STAT3 为UC 研究领域较为有价值的信号通路相关蛋白之一，其激活和过度表达与炎症的发生密切相关[22-24]，STAT3 利用反式传导信号，使IL-6 和受体结合，诱导STAT3 磷酸化后作用于目的基因，引起炎症发生[25]。 本研究主要观察GC 是否能调控STAT3 和NF-κB 信号通路，在Western blot法检测结果中，与模型组比较，GC 抑制UC 小鼠结肠组织中NF-κB 和STAT3 蛋白表达，且差异有统计学意义（P＜0.05）。上述实验结果提示，GC 抗UC 的作用可能与NF-κB 和STAT3 炎症信号通路活化有关。

综上所述，GC 可降低UC 小鼠DAI 评分和改善组织炎症，其抗UC 作用可能与激活炎症信号通路和炎症因子的释放有关，具体机制还有待探讨。