天马颗粒通过FLI-1/Klotho 通路对结肠癌细胞HCT116增殖抑制的作用机制研究

王华帅，谢 彪，罗 敏，何永恒*

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院肛肠科，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南 长沙 410005）

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是世界上第三大最常见的恶性肿瘤[1]。据统计，2018 年全球新发癌症病例总数为1810 万例，癌症死亡人数为960 万人，其中，结直肠癌占总病例的6.1%，占总癌症死亡人数的9.2%[2]。 我国《2019 年全国癌症报告》指出，结直肠癌依然是我国主要的恶性肿瘤之一，仅次于肺癌和胃癌[3]。 国内外研究一致认为，结直肠癌会造成沉重的社会和经济负担[4-5]。 目前，认为其发病涉及肠道菌群、遗传、年龄和表观遗传等因素。现代临床常采用手术、放化疗等方法治疗结直肠癌，但术后患者面临着生存质量低、复发转移率高、药物抵抗等困扰，而中医药治疗结直肠癌具有抗复发转移、提高免疫力、减轻放化疗不良反应及延长生存周期等独特优势[6-7]。

天马颗粒是由何永恒教授结合化痞膏、黄芪益损汤、内消瘰疬丸三方化裁而成，具有“拔癌毒，消结肿，通经络，止疼痛”功效，契合中医治疗结直肠癌中“攻、解、化、散、托”法的科学内涵。 在临床使用中，天马颗粒能有效改善中晚期结直肠癌患者的全身状况和生存质量，延长患者术后5 年生存期，抑制大肠癌术后局部复发[8-11]。在方药组成、质量标准、用药安全等方面不断研究、改进[12-16]，现天马颗粒已获得专利[17]。

小鼠Friend 病毒综合因子1（friend leukemia integration 1, FLI-1）在结肠癌细胞中表达低于正常肠上皮细胞，其过表达可正向调控Klotho 蛋白表达，抑制结肠癌细胞增殖[18]。本实验在前期研究基础上，以HCT116 细胞为研究对象，基于FLI-1/Klotho通路，探究天马颗粒对结直肠癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人结直肠癌细胞株（HCT116）购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CL-0096；8 周龄SD 雄性大鼠10 只，体质量（200±20） g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证：43072720110-1275856，伦理编号：LLBH-202010130001。

1.2 血清制备

使用10 只SD 雄性大鼠制备天马颗粒血清。 按照人-动物体表面积关系换算出大鼠每天中药等效剂量1.86 g/kg，给予相应中药药液灌胃，2 次/d，连续给药7 d。 第7 天灌胃前禁食8 h，2 次灌胃间隔1 h。 采用腹主动脉采血法，离心、提取血清、过滤、灭活补体，保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.3 主要试剂

天马颗粒购买于湖南省中医院，批准号：[湘]卫药剂9706024，规格10×10 g/包，用法：成人1 包/次，2 次/d。 将上述药物加水加热30 min，使药物溶解，过滤；在残渣中继续加水加热30 min，过滤，重复操作，使得药物充分溶解，合并滤液，混合浓缩制备成含药质量浓度为0.09 g/mL 的药液，灭菌后置于4 ℃冰箱保存。

FLI-1 抗体、Klotho 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号：A5644、A12028）；β-actin 抗体（美国proteintech 公司，批号：66009-1-Ig）；mRNA 逆转录试剂盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker（中国北京康为世纪公司，批号：CW2569、CW2601、CW0632）；DEPC（美国Sigma 公司，批号：D5758-25ML）；Tris 缓冲液（美国西格玛公司，批号：V900483）；TRIzol（美国赛默飞公司，批号：15596026）；BCA 蛋白定量试剂盒（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：CW0014S）；EcoRI 限制性内切酶、AgeI 限制性内切酶、T4 连接酶（美国NEB 公司，批号：R3101S、R3552S、M0202S）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（南京诺维赞医疗科技有限公司，批号：A211、DC201、DC301）。

1.4 主要仪器

流式细胞仪（安捷伦科技公司，型号：Novocyte）；摇床、旋涡混合器（中国江苏其林贝尔公司，型号：TS-1、GL-88B）；台式冷冻离心机（中国湖南湘仪公司，型号：H1650R）；荧光PCR 板、荧光定量RCP 仪(美国Thermo 公司，型号：PIKOREAL96、SPL0960)；电泳仪、水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一公司，型号：DYY-2C、DYCP-31DN）；全自动酶标洗板机、多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，型号：PW-812、MB-530）。

1.5 细胞培养

HCT116 细胞株采用McCoy′s 5A+1%青-链霉素双抗培养基，37 ℃，5% CO2条件下常规培养。

1.6 细胞转染与分组

转染前一天将生长至对数期的HCT116 细胞传代至6 孔板，每孔3×105个细胞。第2 天使用PEI 分别转染FLI-1 shRNA 和空载shRNA 质粒[18]，48 h后加入10 μg/mL 的嘌呤霉素进行筛选。

在前期研究中，CCK-8 实验证明，20%浓度天马颗粒血清干预24 h 为HCT116 细胞的最佳干预条 件[15]；将HCT116 细 胞 分 为blank 组、shRNA 组、shTMKL 组、TMKL 组。 blank 组为空白对照，shRNA组为HCT116 细胞瞬时转染FLI-1 shRNA，shTMKL组为shRNA 组基础上加入天马颗粒血清干预，TMKL 组为天马颗粒血清干预HCT116 细胞。 各组细胞培育24 h 后，进行后续实验检测。 所有实验检测均重复3 次。

1.7 Western blot 法检测FLI-1、Klotho 蛋白表达量

将处理过的细胞经胰酶消化后，离心、去上清液，煮沸、变形、电泳，转膜、PBS 洗涤，加入一抗FLI-1(1 ∶1000)、Klotho(1 ∶1000)和 内 参β-actin(1 ∶5000)孵育过夜，经PBST 洗膜后加二抗孵育、洗膜，采用化学发光剂显影，使用Image J 软件进行灰度分析。

1.8 qPCR 检测FLI-1、Klotho mRNA 表达

提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再以得到的cDNA 为模板，按照qPCR 说明书进行反应，检测FLI-1、Klotho mRNA 水平。运用2-ΔΔCt方法进行数据分析。 引物设计见表1。

表1 PCR 引物序列

1.9 流式细胞术检测细胞周期、凋亡

收集处理后的细胞，用预冷70%乙醇固定细胞30 min，用PBS 洗去乙醇后重新离心收集细胞，加入预冷RNase 和PI，避光孵育30 min，筛网过滤后用流式细胞仪检测细胞周期变化。 计算S 期细胞比值（S-phase fraction, SPF)。SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%

收集处理过的细胞，用预冷PSB 洗涤2 次，1000 r/min、4 ℃，离心半径17.8 cm，离心5 min，弃上清液，加入300 μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞。加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL 的PI 染色液混匀后，避光，室温孵育15 min。 用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.10 CCK-8 法检测细胞增殖

将5×103个/mL 细胞液以100 μL/孔接种在96孔板中，培养24 h 和48 h 时每个孔中分别加入10 μL CCK-8 溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm 处A 值。 细胞增殖率=[（对照孔OD 值-实验孔OD 值）/对照孔OD 值]×100%。

1.11 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，Graphpad Prism 6.0 绘图，计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法检测数据正态性，符合正态分布的数据均采用“±s”表示，采用独立样本t 检验，不符合正态分布的数据用中位数（四分位间距）描述，行Mann-Whitney U 检验。

2 结果

2.1 天马颗粒促进FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 相对表达

与blank 组相比，shRNA 组、shTMKL 组FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表达量降低（P＜0.05），TMKL组FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表达量升高（P＜0.05）。与shRNA 组相比，shTMKL 组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA 表达量差异无统计学意义（P>0.05），TMKL组FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表达量升高（P＜0.05）。 与shTMKL 组相比，TMKL 组FLI-1、Klotho蛋白及mRNA 表达量升高（P＜0.05）。 详见表2、图1。

图1 各组FLI-1、Klotho 蛋白相对表达

表2 各组FLI-1、Klotho mRNA 相对表达量比较（±s，n=3）

表2 各组FLI-1、Klotho mRNA 相对表达量比较（±s，n=3）

注：与blank 组相比，*P＜0.05；与shRNA 组相比，＃P＜0.05；与shTMKL组相比，＆P＜0.05。

组别blank 组shRNA 组shTMKL 组TMKL 组F 值P 值FLI-1 mRNA 0.94±0.12 0.68±0.05*0.48±0.02*2.21±0.17*＃＆176.24 0.00 Klotho mRNA 2.32±0.51 1.52±0.13*1.54±0.11*3.44±0.36*＃＆23.54 0.00

2.2 天马颗粒抑制HCT116 细胞增殖

与blank 组相比，shRNA 组HCT116 细胞增殖能力增强（P＜0.05），shTMKL 组、TMKL 组HCT116细胞增殖能力受到抑制（P＜0.05）；与shRNA 组相 比，shTMKL 组、TMKL 组HCT116 细胞增殖能力受 到 抑 制（P＜0.05）；与shTMKL 组相 比，TMKL 组HCT116 细胞增殖能力受到抑制（P＜0.05）。 详见图2A、图2B。

与blank 组相比，shRNA 组SPF 值升高（P＜0.05），shTMKL 组、TMKL 组SPF 值降低（P＜0.05）；与shRNA组相比，shTMKL 组、TMKL 组SPF 值降低（P＜0.05）；与shTMKL 组相比，TMKL 组SPF 值降低（P＜0.05）。详见图2C。

与blank 组相比，shRNA 组总凋亡率降低（P＜0.05），shTMKL 组、TMKL 组总凋亡率升高（P＜0.05）；与shRNA组相比，shTMKL 组、TMKL 组总凋亡率升高（P＜0.05）；与shTMKL 组相比，TMKL 组总凋亡率升高（P＜0.05）。详见表3、图2D。

图2 各组HCT116 细胞增殖、凋亡比较

表3 各组HCT116 细胞凋亡比较（±s，n=3）

表3 各组HCT116 细胞凋亡比较（±s，n=3）

注：与blank 组相比，*P＜0.05；与shRNA 组相比，＃P＜0.05；与shTMKL组相比，＆P＜0.05。

组别blank 组shRNA 组shTMKL 组TMKL 组F 值P 值早期凋亡率/%6.16±0.31 0.47±0.08 9.97±0.51 27.87±0.49 2 808.64 0.00晚期凋亡率/%0.22±0.06 0.23±0.04 1.68±0.20 6.83±0.98 117.80 0.00总凋亡率/%6.38±0.30 0.70±0.09*11.65±0.69*＃34.70±1.24*＃＆1 266.77 0.00

3 讨论

天马颗粒由蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、三棱、胆南星、海藻、黄芪、山药、熟大黄组成。其中君药全蝎、蜈蚣是现代中药抗肿瘤常用药物，广泛用于治疗结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、脑癌及胰腺癌等，全蝎、蜈蚣相须为用，有“不可离之性”。 两药均入肝经，性善走窜，全蝎能穿筋透骨，蜈蚣可通达内外，两药互助，辛散辛开，相辅相成，寒温并用，以“毒”攻毒，达到解毒散结、通络止痛功效。 臣药为半边莲、黄柏，二者配伍相须为用，加强清热解毒功效，助君药解癌毒、清瘀热。 佐药三棱、胆南星、海藻、黄芪、山药，三棱破瘀行气、消积止痛；胆南星清热化痰、息风定惊；海藻能清热消痰、软坚散结；胆南星、海藻配伍加强祛风通络、化痰散结功效；黄芪、山药益气养阴、扶正培本、托毒外出。 使药熟大黄可活血化瘀，使癌毒从下而出，扶正不留邪，配合黄芪攻补兼施。现代药理学研究表明，全蝎抗肿瘤成分为蝎毒，后者对抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用机制涉及Bcl-2 信号蛋白及Caspase-9/Caspase-3、AKT、MAPK、NF-κB 等信号通路[19-23]。 有研究[24-25]发现，蝎毒处理过结肠癌HCT-8 细胞后，细胞出现凋亡富集现象，可能是由于蝎毒增加ROS、上调p53、下调Bcl-2 的表达导致。此外，TAMADON[26]发现蝎毒可以激活Ca2+通道，进而调控Wnt 信号通路，促使细胞凋亡。 LI 等[27]对全蝎提取物多肽Gonearrestide 进行体内外研究，发现其能够通过调控AKT 信号通路中的负调控因子PIP3 和PTEN 表达而抑制HCT116 细胞的增殖。 蜈蚣的抗肿瘤成分包括蜈蚣的醚提取物和醇提取物、生物碱以及分离纯化后的抗肿瘤蛋白。 在对蜈蚣提取物抗肿瘤活性进行体外筛选时，发现对多种癌细胞增殖有抑制作用[28]，其中有4 种组分对结肠癌细胞KM-12 有抑制增殖的作用。 蜈蚣提取液可促进Bax、Bak(促凋亡基因)等基因的表达，从而经线粒体通路抑制癌细胞增殖[29]。此外，利用正交实验设计验证了天马颗粒中的中药均有抑制结肠癌细胞增殖的作用，但各个中药的有效成分还未研究明确[16]。

根据CCK-8 实验，与blank 组相比，TMLK 组HCT116 细胞生长受到抑制； 与shRNA 组相比，shTMKL 组HCT116 细胞生长受到抑制。 可知天马颗粒含药血清可以有效抑制HCT116 结肠癌细胞增殖，这与课题组前期研究结果一致[15，30]。 与blank 组对比，shRNA 组HCT116 细胞增殖能力增强；与shTMKL组对比，TMKL 组HCT116 细胞增殖能力受到抑制。这表明FLI-1 可以抑制HCT116 细胞生长，是抑癌基因。 与blank 相比，shTMKL 组HCT116 结肠癌细胞增殖受到抑制，说明天马颗粒抑制HCT116 细胞增殖，可通过FLI-1 蛋白靶点，还可通过其他靶点抑制癌细胞增殖。 G1 期又称合成前期，此期主要合成RNA 和核糖体。 S 期称DNA 合成期，除了合成DNA外，同时还合成组蛋白。 DNA 复制所需相关酶也在S 期合成。 SPF 值可反映出细胞的增殖能力，在流式细胞周期检测中，与blank 组对比，TMLK 组SPF 值降低；与shRNA 组对比，shTMKL组SPF 值降低。 说明天马颗粒可降低HCT116 细胞增殖能力。同blank组对比，shRNA 组SPF 值降低；同shTMKL 对比，TMKL组SPF 值降低。说明FLI-1 表达可影响细胞周期、抑制细胞增殖。 这个结论同MIAO 等[31]研究结论一致。同blank 组相比，shTMKL 组SPF 降低，说明天马颗粒抑制HCT116细胞周期的调控，可通过FLI-1 蛋白靶点，还可通过其他靶点来调控。 在双染法检测细胞凋亡时，同blank 组对比，TMKL 组总凋亡率升高；同shRNA 组对比，shTMKL 组总凋亡率升高。说明天马颗粒可以诱导HCT116 细胞凋亡。 同blank 组对比，shRNA 组总凋亡率降低；同shTMKL 对比，TMKL 组总凋亡率升高， 可知FLI-1 蛋白表达促进HCT116细胞凋亡。而同blank 组对比，shTMKL 组总凋亡率升高，说明天马颗粒诱导HCT116 细胞凋亡，可通过FLI-1 蛋白靶点，还可通过其他靶点来调控。 由此可推测，天马颗粒可抑制HCT116 细胞增殖、诱导凋亡，FLI-1 蛋白具有抑制HCT116 细胞增殖、诱导凋亡的作用。

FLI-1 属于E26 转录因子（E26 transformationspecific, ETS）转录因子家族中的一员，随着研究的深入，陆续发现FLI-1 在尤文肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌等中是促癌基因[32-34]。 而SCHEIBER等[35]研究的结果却提示，FLI-1 在乳腺癌中是抑癌基因。 前期研究[18]发现，FLI-1 基因在结肠癌中属抑癌基因，可正向调控Klotho 蛋白表达，抑制IGF-1R 和Wnt3a/β-catenin 信号通路，进而抑制结肠癌细胞增殖。 本研究qPCR 及Western blot 实验结果表明，同blank 组 相 比，TMKL 组FLI-1、Klo tho 蛋 白 及mRNA 表达升高，可认为天马颗粒能促进HCT116细胞中FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表达；而同shTMKL 组相比，TMKL 组FLI-1、Klotho 蛋白及mRNA 表达并无差异。结合前期研究[18]“FLI-1 蛋白可以正向调控Klotho 蛋白表达”， 可知天马颗粒可以通过FLI-1 基因调控Klotho 基因表达。 另外，前期研究[18]发现，FLI-1 启动子存在甲基化，去甲基化后FLI-1 蛋白表达增加，因此，推测天马颗粒对FLI-1基因表达的调控机制可能与启动子甲基化有关。

综上所述，天马颗粒可通过促进FLI-1 基因表达，进而上调Klotho 蛋白表达，抑制HCT116 细胞增殖、诱导凋亡。