宫腔镜下宫腔黏连手术后患者血清miR-543、miR-135a表达及预测黏连复发价值

王 青 黄先华 谢 蓉 刘 婷

湖北省宜昌市夷陵区妇幼保健院(443000)

宫腔镜下宫腔黏连分离术是目前临床治疗宫腔黏连的主要治疗手段，可在直视下切除或分离宫腔黏连，但部分患者术后会再复发[1]。研究表明，微小RNA-543(miR-543)参与宫颈癌的发生发展，且对宫颈癌细胞转移及侵袭有重要作用[2]；微小RNA-135a(miR-135a)与宫颈疾病密切相关，可参与调控宫颈癌细胞上皮-间质转化、糖代谢及下游分子机制[3]。miR-543、miR-135a在宫颈癌中的研究较多，但二者与宫腔黏连关系还有待进一步探究。因此，本研究探讨宫腔镜下宫腔黏连分离术后患者血清miR-543、miR-135a水平与复发关系，为临床预防宫腔再黏连提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年12月—2020年12月于本院行宫腔镜下宫腔黏连分离术的127例宫腔黏连患者为研究对象，随访术后3个月经周期后月经第3～7 d，根据复查再次黏连情况分为复发组和未复发组。纳入标准：①符合宫腔黏连诊断标准，且III-IV度[4]；②病例资料及影像学信息完整；③无宫腔镜手术禁忌；④签署知情同意书。排除标准：①有凝血功能障碍、恶性肿瘤；②术后未遵从医嘱规律用药；③合并肝肾功能不全及感染性疾病；④1个月内有重大手术史。收集并整理患者一般资料，主要包括年龄、病程、孕次、术前月经状况、手术时间、宫腔黏连部位、人工流产次数。本研究经院临床研究伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

miRNA提取试剂盒购自美国Life公司；TaqMan miRNA反转录试剂盒购自哈尔滨新海基因检测有限公司；miScriptSYBR Green qPCR Kit购自德国QIAGEN公司；Rox reference dye购自武汉纯度生物科技有限公司。qRT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；宫腔镜(26003BA)购自德国STORZ公司。

1.3 治疗方法

采用宫腔镜进行手术治疗(5%葡萄糖溶液为膨宫液)。患者取膀胱截石位。麻醉后采用宫颈扩张棒扩张宫颈，直至宫颈扩张器深入，确定宫颈黏连程度、部位、类型。宫腔镜视野下采用微型剪钳分离，直至宫腔形态正常，术后宫腔内置O型宫内节育器，常规抗炎并采用雌、孕激素治疗。

1.4 血清miR-543、miR-135a检测

采集患者术后24 h晨空腹静脉血，分别采用miRNA提取试剂盒及反转录试剂盒提取血清总RNA并反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪扩增目的基因miR-543、miR-135a和内参U6。反应体系：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，miScriptSYBR Green qPCR Mix(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，ddH2O 3.0 μl，引物序列见表1。反应条件：95℃ 15 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共40个循环。每个样品重复3次，采用2-ΔΔCT法计算血清中miR-543、miR-135a相对表达量。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 术后复发情况

复发组34例，年龄(35.1±11.5)岁(22～47岁)，未复发组93例，年龄(35.4±11.1)岁(22～48岁)。两组年龄、孕次、术前月经状况、手术时间、宫腔黏连部位、人工流产次数比较无差异(均P>0.05)，病程有差异(P<0.05)。见表2。

2.2 血清miR-543、miR-135a水平

复发组血清miR-135a(1.46±0.29)高于未复发组(1.02±0.23)，miR-543(0.64±0.19)低于未复发组(0.99±0.21)(t=8.879、8.523，均P=0.000)。Pearson法分析显示，复发组血清miR-543与miR-135a水平呈负相关(r=-0.539，P<0.05)。

2.3 血清miR-543、miR-135a水平预测宫腔镜治疗后宫腔黏连复发的价值

ROC曲线分析显示，血清miR-543、miR-135a预测宫腔镜治疗后宫腔黏连复发的曲线下面积(AUC)分别为0.897(95%CI: 0.843～0.950)、0.864(95%CI: 0.790～0.937)，截断值分别为0.854、1.293，特异性分别为76.3%、92.5%，敏感度分别为91.2%、70.6%；二者联合预测的AUC为0.947(95%CI: 0.907～0.987)，特异性为88.2%，敏感度为94.1%。

2.4 影响宫腔镜治疗后宫腔黏连复发的因素分析

将宫腔镜治疗宫腔黏连后是否复发作为因变量，以miR-543、miR-135a、年龄、病程、孕次、术前月经状况、手术时间、宫腔黏连部位、人工流产次数为自变量进行单因素logistic回归分析；再以单因素分析中有统计学意义的miR-543、miR-135a、病程为自变量行多因素logistic回归分析。结果显示，miR-135a是影响宫腔镜治疗宫腔黏连后复发的独立危险因素(P<0.05)，miR-543是复发保护因素(P<0.05)。见表3、表4。

表3 影响宫腔镜治疗后宫腔黏连复发的单因素logistic回归分析

表4 影响宫腔镜治疗宫腔黏连后再复发的多因素logistic回归分析

3 讨论

宫腔黏连又称为Asherman综合征，是各种因素造成子宫内壁黏连而形成的纤维组织增生性疾病[5]。宫腔黏连可导致患者月经减少、闭经、早产、流产甚至不孕[6]。尽管目前宫腔镜下宫腔黏连分离术日益成熟、临床应用较为普遍，但术后再黏连的发生仍不可避免[7]。以往研究中影响宫腔黏连患者术后疗效的危险因素主要集中于宫腔黏连性质、患者病程等方面[8]，关于生物学指标与术后复发的相关性研究较少。

miRNA为小分子非编码RNA，可参与调控基因表达，并在细胞的增殖、分化及凋亡等过程中发挥重要作用[9]。miR-543的功能和表达有一定的组织特异性，在许多肿瘤中表达上调且发挥致癌作用[10]，但在子宫内膜癌及子宫内膜异位相关不孕症患者中呈低表达[11]。miR-135a参与多种恶性肿瘤的发生发展，且起到原癌基因或抑癌基因的作用[12-13]。Petracco等[14]研究表明，miR-135a可能影响子宫内膜功能，影响胚胎着床。

本研究结果显示，宫腔镜治疗后宫腔黏连复发患者的血清miR-543水平低于未复发患者，miR-135a高于未复发患者，二者呈负相关且均是术后再复发的影响因素。提示miR-543低表达、miR-135a高表达可能与宫腔黏连术后复发有关。Liu等[15]研究结果表明，严重宫内黏连患者miR-543及其相应靶基因表达下调，miR-135a-3p表达上调，与本研究趋势一致。基于目前研究，miR-543、miR-135a均对子宫内膜容受性有明显影响[11,14]。本研究推测miR-543、miR-135a异常表达可能通过相互作用影响体内纤维组织增生，进而造成子宫内膜基底层损伤后愈合发生异常，最终宫腔黏连形成并进一步加重，子宫内膜容受性发生改变，发生不良预后。本文分析，患者术后血清miR-543、miR-135a预测宫腔镜治疗后宫腔黏连复发，miR-543预测价值略高于miR-135a，但miR-135a预测时特异性较高达92.5%；且miR-543联合miR-135a的AUC、敏感度均高于单独指标检测。提示临床，可考虑将二者联合作为预测宫腔镜治疗后宫腔黏连复发的参考指标，当miR-543≤0.854、miR-135a≥1.293时提示患者再复发的概率更大。

综上所述，血清miR-543低表达、miR-135a高表达对宫腔黏连患者宫腔镜下宫腔黏连分离术后复发均有重要影响，可作为辅助指标预测、评估患者预后；有效控制宫腔黏连患者术后血清miR-543、miR-135a水平，可能有助于预防再黏连发生。但作为回顾性研究，本研究无法完全排除病例选择的偏倚因素，尚需加大样本量进行前瞻性研究，同时需开展动物或细胞学研究以进一步证实作用机制。