小鼠胰腺对梯度胆囊收缩素的应答

武平，胡立娟，徐晓晴，李秋菊，姚传山，王丰△

肽类激素胆囊收缩素/促胰酶素（cholecystokinin，CCK）可调节消化吸收过程，刺激胰腺生长，也可参与胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的发生发展［1］。食物经过胃的初步消化后，经胃排空分批进入十二指肠和近端空肠。此时食糜中的蛋白和脂肪分解物会刺激小肠黏膜中的I细胞（I cell），使其向血中释放CCK［2］。CCK刺激胆囊和胃幽门的收缩及十二指肠壶腹括约肌的舒张，使胃排空暂停并使胆胰液进入肠腔。随后胰液中的胰蛋白酶会抑制I细胞的CCK分泌，使CCK的效应逐渐减弱。随着胆胰液和食糜混合物抵达远端肠管，相对低的CCK血浓度会导致胃排空的再次发生，而进入肠道的食糜则引发新一轮的CCK分泌及CCK效应［2］。如此循环往复直至胃内容物被全部排空［2］。大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）可使I细胞的CCK分泌不再受到胰蛋白酶的抑制，从而诱发高CCK血症［3］。胰腺包埋化学致癌物二甲基苯并蒽（dimethylbenzanthracene，DMBA）可诱导胰腺癌前病变-胰腺上皮内瘤变（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）［4］。有研究表明，绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）对多种癌症具有潜在的疗效［5］。既往有关CCK的研究多将血CCK升高到某单一水平，而不同程度高CCK血症是否在靶器官引发梯度效应尚未明确，且高CCK血症对胰腺的生理调节及在胰腺癌进展过程中的作用仍存在争议。本研究给予小鼠不同剂量STI，使循环中的CCK水平呈梯度增高，探讨CCK对胰腺生长、消化酶生成的调节作用及胰腺癌发生的影响，并评估EGCG的抗癌潜能。

1 材料与方法

1.1实验材料5～6周龄雄性C57BL/6小鼠58只，体质量18～20 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于南开医院SPF级实验动物中心。小鼠接受12 h/12 h昼夜循环光照，自由摄食和饮水，经1周适应性喂养后进行后续实验。STI（批号210610，抑制胰蛋白酶活性≥3 000 U/mg，上海如吉生物科技有限公司）；DNA提取试剂盒（天津博诚科技有限公司）；小鼠胰脂肪酶酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（EEL-M2448c，武汉伊莱瑞特生物科技公司）；胰蛋白酶测定试剂盒（紫外比色法，A080-2，南京建成生物工程研究所）；小鼠胆囊收缩素ELISA试剂盒（CSB-E08115m，武汉华美生物工程有限公司）；三溴乙醇（T48402）、DMBA（D3254）均购自美国Sigma-Aldrich公司；Pierce BCA蛋白定量试剂盒（23225，Thermo Fisher Scientific，美国）；ABC免疫组织化学染色试剂盒（PK-6200，Vector laboratories，美国）；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（DA1015）、EGCG（E8120）、中性树胶（G8590）、EDTA抗原修复液（50×）pH8.0（C1034）均购自北京索莱宝科技有限公司；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（AB92552，Abcam，英国）；Co60大小鼠维持饲料（SPF-F02-002，斯贝福北京生物技术有限公司），含粗蛋白18%，粗脂肪4%；组织匀浆机（Tissue Master 125，OMNI International，美国）；酶标仪（ST360，上海科华实验系统有限公司）；Thermo ScientificTMNano Drop 2000分光光度计；紫外分光光度计（Gene Quant 1300，Biochrom，英国）；正置显微镜（DM4000B）、组织脱水机（ASP200S）、石蜡切片机（RM2235）、组织包埋机（EG1150H+C）、摊 片机（H1210）、烤片机（H1220）、Leica 819一次性窄刀片（14035838925）均购自德国Leica公司；改良Lillie-Mayer苏木素染色液（DH0001）、伊红染色液（DH0044）均购自北京雷根生物技术有限公司。

1.2动物实验（1）生理研究。采用随机数字表法将小鼠分为0 g/L STI组（n=11）、2 g/L STI组（n=11）、4 g/L STI组（n=10）、8 g/L STI组（n=11），分别给予含0、2、4和8 g/L STI的饮水。经STI干预2周后，小鼠禁食18 h，从内眦采集血液至含EDTA二钾的抗凝管中，离心（1 500×g，15 min，4℃）获取血浆。小鼠采用颈椎脱位法处死，剖开腹腔，切除胰腺，记录胰腺湿质量。将胰腺分为两部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分于-80℃保存，用于后续检测。（2）癌发生研究。采用随机数字表法将剩余小鼠分为正常对照组、DMBA包埋组、DMBA+2 g/L STI组、DMBA+8 g/L STI组、DMBA+8 g/L STI+EGCG组，每组3只。将0.05 mg DMBA超声后混悬于10 μL生理盐水中，得到DMBA混悬液。小鼠禁食16 h后，腹腔注射2，2，2-三溴乙醇（0.3 mg/g）麻醉。在加热垫上经剃毛和腹部皮肤消毒后，打开腹腔暴露脾，用镊子轻拉出胰腺尾部，用注射器将10 μL DMBA混悬液注射入胰腺，用棉棒轻压注射口防止液体渗出，使用连续缝合逐层关闭壁层腹膜和骨骼肌，间断缝合皮肤创面。小鼠术后禁食24 h，术后4 h皮下注射0.6 mL生理盐水（含10%葡萄糖）。STI处理组于DMBA包埋1周后进行STI处理。DMBA+8 g/L STI+EGCG组每天腹腔注射EGCG（25 mg/kg，生理盐水溶解）。DMBA包埋6周后处死小鼠，将胰腺置于4%多聚甲醛固定后进行组织学分析。

1.3检测方法

1.3.1血浆CCK水平检测将标准品和血浆样品移入ELISA板孔中，37℃孵育2 h，倾去不洗，将生物素偶联抗体添加到孔中，孵育后PBS清洗3次，每次3 min，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育，洗涤去除未结合的亲和素酶试剂，添加底物溶液，37℃水浴箱中孵育20 min，加入终止液，使用酶标仪在450 nm波长处测量吸光度（A）值，最后通过标准曲线计算CCK水平。

1.3.2胰腺组织中蛋白质含量测定将胰腺组织用PBS清洗，将含1%PMSF的RIPA裂解液与之混合后在冰上用组织匀浆器匀浆，离心（10 000 r/min，15 min，4℃）后将上清液和牛血清白蛋白标准品加入96孔板中，每孔10 μL，将试剂盒中的A液与B液按照50∶1的比例配成工作液，每孔加100 μL，放入37℃水浴箱中，孵育30 min显色，在波长为570 nm处用酶标仪读取A值，根据标准曲线公式计算胰腺组织中的蛋白质含量。

1.3.3胰腺组织中DNA含量测定冰浴下研碎胰腺组织，精确称量后与试剂盒中的裂解液混合，按照说明书经过离心等操作后最终出现白色沉淀，使用无水乙醇清洗后干燥得到组织中的DNA，将其溶解于一定体积的双蒸水中，用Thermo ScientificTMNanoDrop 2000分光光度计测定DNA浓度，计算胰腺组织中的DNA含量。

1.3.4胰腺组织中胰蛋白酶含量测定精确称量胰腺组织并加入9倍体积的匀浆介质，冰浴条件下机械匀浆，离心（2 500 r/min，10 min，4℃）后取上清液。上清液与底物混合后放入37℃水浴箱中孵育并计时，在30 s时倒入石英比色皿中，于253 nm处使用紫外分光光度计读取吸光度（A）1值后放回水浴中，并在20 min后再次读取A2值，计算两次差值ΔA=A2-A1，根据胰腺组织的质量和ΔA值计算胰蛋白酶量。

1.3.5胰脂肪酶含量测定冻存的胰腺组织称质量后，按照1∶9的比例加入PBS在冰浴中制成匀浆，将样品和标准品中加入板中37℃孵育1.5 h，甩尽孔内液体，不洗。每个孔中加入生物素化抗体工作液100 μL，酶标板加覆膜，37℃温育1h，甩尽孔内液体。每孔加洗涤液350 μL，浸泡1 min倾去，洗涤3次。每孔加酶结合物工作液100 μL后37℃温育30 min，洗涤后，加入显色底物，观察到反应呈现蓝色后，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测量A值，通过绘制标准曲线计算样品的浓度。

1.3.6胰腺免疫组织化学染色采用免疫组织化学染色检测胰腺组织PCNA阳性细胞百分比。小鼠胰腺经过4%多聚甲醛溶液固定和石蜡包埋后切为4 μm厚切片，切片于二甲苯脱蜡后梯度乙醇脱水。使用EDTA缓冲液微波15 min抗原修复，自然冷却后用PBS漂洗3次，每次5 min，随后置于湿盒内滴加3%过氧化氢溶液孵育20 min。洗涤后，使用马血清室温下封闭2 h，倾去不洗，滴加PCNA抗体（1∶200）置于4℃孵育过夜。次日复温30 min后再洗涤，滴加试剂盒中提供的生物素标记的马抗兔抗体，常温孵育30 min。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液孵育15 min。洗涤后滴加DAB显色液显色2～3 min，浸入自来水中止显色。苏木素复染、脱水、透明，中性树胶封片，镜下观察PCNA表达情况。每组随机读取15个视野进行检查，并统计阳性细胞所占总细胞数比例。

1.3.7胰腺组织HE染色癌发生实验的胰腺组织行HE染色后进行病理学诊断。组织制成4 μm切片，37℃恒温烘烤24 h。切片放入二甲苯中脱蜡10 min；经无水乙醇脱水10min，双蒸水洗后入苏木素染核2 min，经盐酸乙醇分色后水洗再入氨水蓝化，入伊红染液2 min；经乙醇脱水；二甲苯透明封片后光学显微镜下观察，参照PanIN分级标准进行病理学诊断。

1.4统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠循环中CCK水平及胰腺湿质量2 g/L STI组CCK水平高于0 g/L STI组（P＜0.05），4 g/L STI组CCK水平与0、2 g/L STI组差异无统计学意义（P＞0.05），8 g/L STI组CCK水平均高于0、2和4 g/L STI组（P＜0.05）。2、4 g/L STI组胰腺湿质量高于0 g/L STI组（P＜0.05）；4 g/L STI组胰腺湿质量与2 g/L STI组差异无统计学意义（P＞0.05）；8 g/L STI组胰腺湿质量高于0、2 g/L STI组（P＜0.05），与4 g/L STI组差异无统计学意义。见表1。

Tab.1 Comparison of CCK concentration and pancreatic wet mass of mice between the four groups表1各组小鼠CCK水平及胰腺湿质量比较（±s）

Tab.1 Comparison of CCK concentration and pancreatic wet mass of mice between the four groups表1各组小鼠CCK水平及胰腺湿质量比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与0 g/L STI组比较，b与2 g/L STI组比较，c与4 g/L STI组比较，P＜0.05。

组别0 g/L STI组2 g/L STI组4 g/L STI组8 g/L STI组F n 11 11 10 11 CCK（ng/L）57.33±15.23 79.08±13.13a 67.06±9.62 92.84±9.25abc 17.512＊＊胰腺湿质量（mg）152.64±17.74 185.73±31.92a 198.80±29.02a 220.45±43.66ab 8.619＊＊

2.2 小鼠胰腺蛋白质和DNA含量比较2、4 g/L STI组蛋白质和DNA含量高于0 g/L STI组（P＜0.05），4 g/L STI组蛋白质和DNA含量与2 g/L STI组差异无统计学意义（P＞0.05），8 g/L STI组蛋白质和DNA含 量 高 于0、2和4 g/L STI组（P＜0.05）。见表2。

2.3 小鼠胰腺中消化酶含量0、2、4和8 g/L STI组胰蛋白酶含量依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。2、4、8 g/L STI组胰脂酶含量高于0 g/L STI组（P＜0.05），2、4、8 g/L STI组胰脂酶含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

Tab.2 Comparison of protein and DNA content in pancreas of mice between the four groups表2各组小鼠胰腺蛋白质和DNA含量比较（±s）

Tab.2 Comparison of protein and DNA content in pancreas of mice between the four groups表2各组小鼠胰腺蛋白质和DNA含量比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与0 g/L STI组比较，b与2 g/L STI组比较，c与4 g/L STI组比较，P＜0.05。

组别0 g/L STI组2 g/L STI组4 g/L STI组8 g/L STI组F n 11 11 10 11蛋白质含量（mg）14.30±2.37 19.70±4.72a 20.63±4.49a 25.85±5.68abc 12.252＊＊DNA含量（μg）228.29±27.03 281.87±35.36a 299.26±34.12a 346.62±32.88abc 24.892＊＊

Tab.3 Comparison of digestive enzymes of pancreatic tissue of mice between the four groups表3各组小鼠胰腺组织中消化酶含量比较（±s）

Tab.3 Comparison of digestive enzymes of pancreatic tissue of mice between the four groups表3各组小鼠胰腺组织中消化酶含量比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与0 g/L STI组比较，b与2 g/L STI组比较，c与4 g/L STI组比较，P＜0.05。

组别0 g/L STI组2 g/L STI组4 g/L STI组8 g/L STI组F n 11 11 10 11胰蛋白酶含量（U/mg）5.53±0.62 6.86±0.57a 7.98±0.57ab 9.74±0.88abc 76.520＊＊胰脂酶含量（ng/g）325.89±63.38 435.03±35.89a 468.73±82.43a 469.35±96.56a 9.391＊＊

2.4 小鼠胰腺组织中PCNA阳性细胞结果0、2、4、8 g/L STI组小鼠胰腺组织PCNA阳性细胞比例依次升高，分别为1.93%±1.75%、3.60%±1.40%、5.00%±2.14%、6.60%±2.06%，差 异 有 统 计 学 意 义（F=17.120，P＜0.05），见图1。

2.5 CCK和EGCG对胰腺癌发生的作用与正常对照组相比，DMBA包埋组出现胰腺导管的细胞核拥挤和排列紊乱现象，在DMBA+2 g/L STI组中加重且出现核深染。DMBA+8 g/L STI组还出现了由间变细胞组成的条索状病灶。在DMBA+8 g/L STI+EGCG组中癌前病损的程度有所减轻，见图2。

3 讨论

Fig.1 Results of immunohistochemical staining of PCNA in pancreas(scale=25 μm)图1小鼠胰腺组织PCNA免疫组织化学染色结果（比例尺=25 μm）

Fig.2 Effects of CCK and EGCG on neoplastic lesion in mouse pancreas embedded with DMBA(scale=25 μm)图2 CCK和EGCG对胰腺包埋DMBA小鼠癌发生的作用（比例尺=25 μm）

胰腺是人体的重要消化腺，分为内外分泌腺两大部分，其中外分泌腺可以分泌胰液。胰液内含有各种消化酶，胰酶分泌是促进营养物质消化和吸收的重要步骤，胰蛋白酶和胰脂酶是胰酶的重要组成成分［6］。胃肠激素CCK可调节机体的消化和吸收过程，刺激胰腺消化酶的生成和分泌，并刺激胰腺生长，也可参与胰腺癌的发生发展［1］。STI是一种大豆蛋白且具有胰蛋白酶抑制活性，可使I细胞的CCK分泌不再受到抑制，从而提升循环中CCK水平［3］。既往有关CCK的研究多将血CCK升高到某单一水平，而不同程度高CCK血症是否对靶器官有不同的效应尚未明确。

本实验分别给予小鼠含不同质量浓度（0、2、4和8 g/L）的STI，在其体内诱导不同程度CCK水平，结果显示：（1）2、4 g/L STI组胰腺湿质量高于0 g/L STI组，8 g/L STI组胰腺湿质量高于0、2 g/L STI组。（2）2、4 g/L STI组胰腺蛋白质含量和DNA含量高于0 g/L STI组，8 g/L STI组蛋白质含量和DNA含量高于0、2和4 g/L STI组。（3）0、2、4和8 g/L STI组胰蛋白酶含量依次升高；2、4、8 g/L STI组胰脂酶含量高于0 g/L STI组。以上结果提示循环中CCK水平不同可导致胰腺不同程度增生，胰酶生成。此法因制备简单，且CCK水平可控，较通过手术方式将携带胆胰总管的十二指肠转移到远端小肠的高CCK血症模型即胰胆转流术（pancreatobiliary diversion，PBD）更有前景［7］。

PCNA是反映细胞增殖状态的指标，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。本研究结果显示，0、2、4、8 g/L STI组小鼠胰腺组织PCNA阳性细胞比例依次升高；此结果与CCK循环水平、胰腺湿质量和胰腺内DNA含量的结果基本一致，进一步证实胰腺在受到CCK刺激后发生了增生。

近年来，中国胰腺癌发病率和死亡率呈明显上升趋势，且在男性和老年人群中尤为明显；胰腺癌早期缺乏特异症状，确诊时多已不能手术治愈，加之对放化疗不敏感，中位生存期多不足半年［8-9］。目前有关CCK刺激胰腺癌发生的机制尚未明确。CCK受体（cholecystokinin receptor，CCKR）属G蛋白偶联受体，胰岛素受体（insulin receptor，IR）属受体酪氨酸激酶家族（receptor tyrosine kinase，RTK），这两种受体在胰腺癌的发生和发展过程中起到了重要作用［10-11］。EGCG是茶叶中的主要儿茶素，约占59%。EGCG作为绿茶中的有效成分，具有抗炎、抗菌和抗氧化等多种作用。因EGCG具有IR拮抗剂的作用［12］，其抗癌作用越来越受到关注［5，10］。本研究结果显示，随着CCK水平增高，胰腺组织的癌前病变程度有加重趋势，而EGCG可减轻高CCK血症诱导的胰腺癌前病变的程度，其原因可能与CCKR与IR的信号传导间存在偶联有关，但此种偶联关系尚未明确，阐明此偶联关系可能会对胰腺癌的防治有重要意义。

综上所述，不同剂量STI能诱发不同程度的高CCK血症，CCK可刺激胰腺增生、胰酶生成及胰腺癌的发生，而EGCG具有减轻胰腺癌前病变的作用。