基于Nrf2/HO-1信号通路4-辛基衣康酸对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的作用

王乐，廖琳玲，颜伟健，肖姣倩，李智英，田梦缘

(1.邵阳学院 基础医学院，湖南 邵阳，422000；2.邵阳学院附属第二医院，湖南 邵阳，422000；3.邵阳学院第二临床学院，湖南 邵阳，422000)

脓毒症是由感染、创伤等伤害性刺激引起的全身性炎症反应综合征，是导致重度感染患者死亡的主要因素[1]，肺是脓毒症时最易受损的器官之一[2]。脓毒症导致的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)若不及时治疗，严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，是导致患者死亡的直接原因之一[3]。ALI/ARDS发病机制迄今尚未完全阐明，其防治仍然缺乏针对性手段，因此，如何早期有效干预ALI，并阻止其发展为ARDS具有重要意义。

衣康酸是三羧酸循环过程中的衍生物之一，最近有研究报道衣康酸衍生物4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate,4-OI)是一种新的有效的核因子NF-E2相关因子 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)激活剂，可发挥抗炎效应，提高内毒素休克小鼠的生存率[4]，但衣康酸是否对急性肺损伤具有保护作用尚未见相关研究。本研究通过腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)建立ALI小鼠模型, 探索衣康酸能否减轻ALI及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性ICR小鼠，6～8周龄，体重为25～30 g(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)。动物实验经邵阳学院伦理委员会审查批准通过。

1.2 试剂

4-辛基衣康酸购自TargetMol中国公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、丙二醛(malon dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；抗Nrf2兔多克隆抗体、抗HO-1兔多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔IgG抗体均购自美国Proteintech Group公司；BCA蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。IL-1β ELISA试剂盒购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 实验动物分组和造模

ICR小鼠被随机分为对照组、LPS组和4-OI+LPS组3组，每组5只。腹腔注射LPS(10 mg/kg)进行ALI造模，4-OI+LPS组小鼠在注射LPS前2 h腹腔注射4-OI(50 mg/kg)进行干预，对照组和LPS组动物在相应时间点接受相同体积的溶剂。在 LPS 给药后6 h，各组小鼠予以2%戊巴比妥钠麻醉，股动脉放血处死，收集标本用于后续实验。

1.4 肺组织匀浆制备

准确称量肺组织加入匀浆介质(1∶9)，充分匀浆后，制成10%组织匀浆，4 ℃、 3 000 r/min离心10 min后，取上清液备用。

1.5 肺湿/干(W/D)重量比测定

计算肺 W/D 作为肺水肿的指标。切下每只小鼠的左肺测定湿重，然后置于37 ℃烘箱中48 h，待其重量不再减少后，再称重测定其干重，计算肺W/D。

1.6 肺组织SOD活性、MDA含量、MPO活性检测

根据试剂盒说明书测定肺组织SOD、MDA和MPO。

1.7 肺组织匀浆IL-1β含量测定

取10% 肺组织匀浆上清液，按ELISA试剂盒说明书进行IL-1 β含量测定。

1.8 蛋白质印迹法检测肺组织Nrf2和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达

提取部分肺组织，用预冷PBS清洗后，加入RIPA裂解液于生物样品均质仪中反复研磨组织直至看不见组织块。4 ℃，12 000 r/min离心 15 min，收集上清冻存于-80 ℃待用。加样后将缓冲液加入样本中，混匀，煮5 min，10 000 r/min离心10 min，等量上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转到NC膜，5%脱脂奶粉封闭，滴加一抗孵育，4 ℃过夜，次日室温放置30 min，应用二抗与膜共同室温孵育90 min。最后，ECL显色曝光，显影冲洗。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 4-OI对各组小鼠肺组织W/D和MPO的影响

在LPS注射6 h后，LPS组动物的W/D明显高于对照组的动物。4-OI+LPS组动物的肺肿胀降低，W/D明显低于LPS组(P<0.05)，见表1。4-OI的预处理还显著减少了LPS引起的MPO活性增加(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠肺组织W/D、MPO活性和IL-1β的比较

2.2 4-OI对各组小鼠细胞因子IL-1β水平的影响

与对照组相比，LPS诱发的急性肺损伤小鼠肺匀浆中IL-1 β水平明显增加(P<0.01)，见表1。4-OI 抑制了急性肺损伤小鼠中易感因素IL-1β的释放。

2.3 4-OI对各组小鼠肺组织SOD和 MDA的影响

LPS增加了小鼠肺组织中MDA的形成(P<0.01)，用4-OI预处理的小鼠肺组织中的MDA含量低于LPS组(P<0.05)。此外，LPS还降低了小鼠肺组织中的SOD水平(P<0.01)，这种效果通过4-OI的预处理显著逆转(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠肺组织MDA和SOD的比较

2.4 4-OI对各组小鼠肺组织Nrf2和HO-1含量的影响

如图1所示，LPS组小鼠肺组织中Nrf-2和HO-1表达水平与对照组相比显著下调(P<0.01)，Nrf-2和HO-1蛋白水平在4-OI预处理后得到提高(P<0.05)。

*P<0.05；**P<0.01;#P<0.05图1 各组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1的表达水平比较(n=5)Fig.1 Comparison of Nrf2 and HO-1 expression levels in lung tissue of mice in each group (n=5)

3 讨论

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，LPS作为内毒素的主要成分，也是引起ALI的常见致病因子，本研究采用腹腔注射LPS制备急性肺损伤小鼠模型，从而用于评估衣康酸对ALI的保护作用及机制。本研究表明，LPS造模6 h后，LPS组小鼠肺组织出现W/D升高，提示出现肺水肿，而肺间质水肿是肺损伤的主要病理特征，说明小鼠AIL造模成功。

4-OI是一种衣康酸衍生物，具有较强的细胞通透性，研究显示，4-OI可通过促进Nrf2活化发挥抗炎作用，在体外可明显抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-1β的产生，动物实验中也显示，4-OI可降低内毒素休克小鼠血浆中炎症因子IL-1β和TNF-α水平，提高内毒素休克小鼠的生存率[4]。本研究发现，4-OI预处理后可使ALI小鼠肺组织W/D值、MPO活性、IL-1β均明显降低，提示4-OI可减轻ALI引起的肺水肿和炎症反应。

氧化应激也参与了ALI的发生发展，MDA、SOD是反映机体氧化应激情况的常用指标，其中SOD具有抗氧化作用。本研究显示，与对照组相比，LPS组小鼠肺组织中SOD活力降低、MDA含量升高，但4-OI预处理后可改善此变化，提示4-OI可能通过抑制ALI小鼠的肺组织氧化应激而减轻肺部损伤。

Nrf2是转录因子CNC(cap’n’collar)家族的一员，在肺、消化道、肾等器官广泛表达[5]。当机体受到刺激处于氧化应激状态时，Nrf2可通过促进下游HO-1等抗氧化酶基因的转录，保护机体免受活性物质的侵害。HO-1及其代谢产物对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞介导的炎症反应具有一定的抑制作用[6]，可通过减少促炎细胞因子的产生而表现出抗炎作用[7]。近年来多项研究表明,Nrf2/HO-1信号通路与ALI关系密切，上调肺Nrf2/HO-1表达可能对肺发挥一定的保护作用[8-9]。本研究结果显示，LPS可使Nrf2/HO-1信号通路活性降低，与以前的研究报道相一致[10]，4-OI可上调LPS组小鼠肺组织中Nrf2和HO-1表达水平，说明4-OI可激活ALI小鼠肺组织中Nrf2/HO-1通路。

综上所述，4-OI可通过减少氧化应激和炎症反应改善LPS诱导的ALI，这可能与激活Nrf2/HO-1通路有关，这可为临床探索防治ALI的发生提供新的思路和途径，也为衣康酸的生物学作用提供新的认识。