超声介导缓释型载药纳米粒促进抗结核药物增效杀菌的实验研究

张志飞 胡璨 杜永洪 杨敏

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的世界上第二大传染病，2020年全球新发结核病患者约990万，与结核病感染直接相关死亡患者约161.4万［1-2］。结核病治疗的特殊性和难治性主要在于MTB细胞壁含有大量脂质，结构致密，且感染后易形成纤维病灶并包裹形成结核球，导致药物难以进入MTB菌体内发挥有效的杀菌作用［3-4］。研究［5-6］表明，超声辐照能提高细胞膜通透性，其所致的声孔效应可使细胞膜表面产生临时通道，为药物进入细胞内创造了有利条件，可增强多种细菌对抗菌药物的敏感性，从而提高杀菌效果。另一方面，纳米载药递送系统通过药物在靶组织的缓释作用，具有提高药物疗效、减少药物用量、降低毒副作用等优点，在抗肿瘤、高耐药率（如多药耐药细菌）和生物膜相关感染的治疗中备受关注［7-8］。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）是一种减毒牛结核分枝杆菌活株，与MTB具有相似的细胞壁结构和成分，常被用于替代MTB的基础研究［9］。本实验选择药物作用靶点在MTB细胞内的抗结核药左氧氟沙星（levofloxacin，LEV），应用聚乳酸-羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）共聚物高分子材料制备载LEV缓释纳米粒（levofloxacin nanoparticles，LEV-NPs），旨在探讨超声介导LEV-NPs对减毒牛结核分枝杆菌的体内外增效杀菌作用。

材料与方法

一、主要实验动物、材料及仪器

1.实验动物：健康雌性SD大鼠20只，6～8周龄，体质量约200 g，来自重庆医科大学动物实验中心。

2.主要材料：BCG菌株冻干粉购自成都生物产品研究所（批号：S20013057）。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH）购自济南岱罡生物科技有限公司；4%聚乙烯醇、2%异丙醇、7H9肉汤培养基、甘油、OADC增菌液、活细菌/死细菌双染（SYTO 9/PI）试剂盒均购自美国Sigma公司。

3.主要仪器：低频低强度超声治疗仪（苏州工业园区海纳科技有限公司），换能器直径45 mm，固定频率42 kHz，输出声强0.15～0.60 W/cm2；马尔文激光粒度仪（3000 HS，英国Malvern公司）；激光共聚焦显微镜（A1+/A1R+，日本Nikon公司）；场发射扫描电镜（SU 8010）和透射电镜（H-7500）均购自日本Hitachi公司；紫外可见分光光度计（Nano Drop 2000，美国Therm Scientific公司）。

二、实验方法

1.BCG培养及最小抑菌浓度检测：将BCG菌株冻干粉复苏后，接种于7H9肉汤培养基中，3周后离心重悬收集菌液，调整菌液浓度为107CFU/ml备用。按照美国国家实验室标准委员会抗菌药物敏感性试验操作标准检测LEV对BCG的最小抑菌浓度。

2.LEV-NPs的制备及物理特性检测：采用双乳化法制备LEV-NPs。将40 mg PLGA-COOH完全溶于2.0 ml三氯甲烷形成有机相，加入0.2 ml LEV水相，采用声震仪声震60 s形成初乳，然后加入4%聚乙烯醇，声震150 s形成复乳，再加入6.0 ml 2%异丙醇，室温下磁力搅拌3～6 h后，离心、洗涤收集得到LEV-NPs。采用马尔文激光粒度仪检测LEV-NPs的粒径和Zeta电位；场发射扫描电镜和透射电镜观察LEV-NPs的形态和结构；紫外可见分光光度计检测LEV-NPs的载药率、包封率。

3.LEV-NPs药物释放情况：采用透析袋法检测LEV-NPs在自然条件下及超声辐照后下的药物累计释放量。称取20 mg LEV-NPs干粉溶于2 ml PBS缓冲液中，采用声强0.15 W/cm2的超声辐照10 min，然后将样品转移到透析袋中。将透析袋放入含有25 ml PBS缓冲液的烧杯中，在37℃下以120 r/min的速度摇动烧杯，使烧杯中的溶液均匀化。在预定的时间点（0、2、4、8、10、12、24、48、60、72 h）取2 ml透析液，在烧杯中加入等量体积的PBS缓冲液。使用紫外可见分光光度计测量303 nm处LEV的吸收值，计算LEV累积释放率，公式为：LEV累积释放率=（PBS缓冲液中的LEV量/LEV-NPs中的LEV总量）×100%。

4.体外实验分组及方法：将制备好的BCG菌液加入30 mm培养皿中，随机分为4组：①LEV组，加入1 ml LEV，调整培养皿内最终浓度为4.0 μg/ml（此浓度为LEV对BCG的最小抑菌浓度）；②超声联合LEV组，加入1 ml LEV，调整培养皿内最终浓度为4.0 μg/ml，然后立即经超声辐照；③超声联合LEV-NPs组，加入1 ml LEV-NPs，调整培养皿内药物最终浓度为4.0 μg/ml，然后立即经超声辐照；④对照组，加入1 ml PBS缓冲液。超声联合LEV组和超声联合LEV-NPs组的超声辐照方法一致，均于培养皿底部均匀涂抹耦合剂，平面换能器紧贴培养皿底部，辐照参数均为声强0.15 W/cm2，连续辐照10 min。实验处理24 h后，采用平板菌落培养计数法检测各组活菌落数，计数结果经Log10对数处理后进行统计学处理。应用SYTO 9/PI试剂盒对各组细菌进行染色标记，其中SYTO 9可将活菌标记为绿色荧光，而PI可与死菌DNA结合显示为红色荧光，于激光共聚焦显微镜下观察各组BCG活死菌变化情况。取各组菌液制成爬片，沿孔壁加入固定液，4℃冰箱保存，于场发射扫描电镜下观察BCG表面结构。

5.体内实验建模、分组及方法：选取20只健康雌性SD大鼠，右侧臀部常规脱毛消毒，皮下注射浓度为107CFU/ml的BCG菌液1 ml，注射14 d后观察注射部位局部凸起情况，取组织行抗酸染色，以组织中见红色杆状BCG细菌即证实皮下BCG结核肉芽肿模型成功建立。将成功建模的SD大鼠随机分为4组：①LEV组，皮下局部注射1 ml LEV（浓度为5.0 mg/ml）；②超声联合LEV组，皮下注射1 ml LEV（浓度为5.0 mg/ml）后立即经超声辐照；③超声联合LEV-NPs组，皮下注射1 ml LEV-NPs（药物浓度为5.0 mg/ml）后立即经超声辐照；④对照组，皮下注射1 ml生理盐水。超声联合LEV组和超声联合LEV-NPs组的超声辐照参数一致，均为声强0.15 W/cm2，连续辐照10 min。在治疗后第3、7、14天分别测量各组大鼠皮下BCG结核肉芽肿体积，计算并比较各组治疗效果。

三、统计学处理

应用Graph Pad Prism 9.0统计软件，计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LEV-NPs的物理特性和药物释放情况

镜下见制备好的LEV-NPs呈球形，大小均一，分散性良好，LEV成功包载入纳米粒内部。见图1。LEV-NPs粒 径 为（282.42±3.55）nm，Zeta电 位 为-（20.40±0.63）mV，载药率、包封率分别为6.21%、65.30%。LEV-NPs在24、48、72 h自然条件下LEV累计释放率分别为31.2%、45.7%、46.9%；超声辐照后24、48、72 h时LEV累计释放率增加，分别为42.7%、65.0%、67.7%。见图2。

二、体外实验各组BCG细菌活性及其表面结构

1.各组细菌活性检测结果见图3。对照组、LEV组、超声联合LEV组、超声联合LEV-NPs组活菌落数分别为：（7.50±0.34）Log10CFU/ml、（5.98±0.08）Log10CFU/ml、（4.58±0.36）Log10CFU/ml、（1.96±0.03）Log10CFU/ml；其中超声联合LEV-NPs组细菌活性下降最明显，菌落存活率约26%，低于LEV组及超声联合LEV组（80%、61%），差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.各组活死菌变化情况见图4。对照组及LEV组中以绿色荧光为主，提示活菌落更多；超声联合LEV组中菌落分散，死菌明显增多；超声联合LEV-NPs组可见视野下呈明亮的红色荧光，以死菌为主，仅见少量活菌落。

3.各组细菌表面结构变化见图5。对照组中细菌呈杆状，形态完整，聚集分布；LEV组细菌聚集性降低，少量菌体结构不完整，提示细菌受到一定损伤；超声联合LEV组细菌分散，菌体结构破坏严重，视野下可见较多断裂菌体；超声联合LEV-NPs组细菌数量明显减少，菌体伸展、断裂，细菌损伤情况最严重。

三、体内实验各组皮下BCG结核肉芽肿体积变化

各组大鼠治疗后皮下BCG结核肉芽肿体积变化见图6，7。肉眼观可见超声联合LEV-NPs组治疗后结核肉芽肿体积较其他各组明显减小。连续测量各组治疗后结核肉芽肿体积，结果显示：对照组结核肉芽肿体积在第14天较治疗前增加约2倍；LEV组结核肉芽肿体积在第14天未见明显减小；超声联合LEV组结核肉芽肿体积呈下降趋势，在第14天较治疗前减小约18%；超声联合LEV-NPs组结核肉芽肿体积减小最明显，在第14天体积约79 mm3，较对照组减小约80%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

讨 论

结核病防治是世界性重大公共卫生问题，特别是多重耐药结核病和广泛耐药结核病使临床治疗面临严峻挑战［10］。研究［4］发现有两种机制被认为与天然耐药有关，即MTB细胞壁通透性屏障和活性多药外排泵基因表达。随着对MTB生物学认识的深入，改变致密细胞壁结构、增强药物渗透性是抑制日益增加的结核耐药的关键［11］。

超声作为一种微无创技术已在多种疾病诊疗中得到广泛应用。其中低频低强度超声已被证实对皮肤、实体肿瘤等宏观组织及细胞膜、细胞壁等微观结构具有明显的促渗作用［12］。此外，其安全性亦不可忽视，本课题组前期通过交叉试验筛选出声强0.15 W/cm2的超声波连续辐照10 min对皮肤无明显病理结构损伤，同时具有良好的促渗作用［13］。由于超声可以改善载药纳米粒在特定位置的释放潜力，载药纳米粒获得适当的超声波能量后其药物释放能力显著提高［14］。本实验结果发现，制备的LEV-NPs物理特性稳定，载药率、包封率分别为6.21%、65.30%。自然条件下LEV-NPs在24、48、72 h的LEV累计释放率分别为31.2%、45.7%、46.9%，表明LEV-NPs具有明显的药物缓释特性。超声辐照后24、48、72 h时LEV累计释放率增加，分别为42.7%、65.0%、67.7%，表明超声辐照可促进纳米粒中药物的释放，提高缓释效率，有效增加局部感染区的药物含量。另一方面，纳米粒是有效的外源性空化核，在超声促发纳米粒爆破的过程中，更多的空泡膨胀坍塌所产生的激波和微射流是产生“声孔”促进药物渗入的根本原因［15］。本实验中超声联合LEV-NPs组利用超声促进缓释型载药纳米粒加速释药，并通过声孔效应促进药物渗入，在体内外实验中表现出的抗菌效果均显著高于其余各组，表明二者具有协同增效杀菌作用。

本实验探讨了超声介导LEV-NPs对减毒牛结核分枝杆菌的体内外增效杀菌作用，体外实验结果显示超声联合LEV-NPs组细菌分散、菌体结构破坏，细菌活性下降最明显，菌落存活率仅26%。同时使用激光共聚焦显微镜观察各组活死菌含量结果可知，超声联合LEV-NPs组杀菌效果也优于其余各组，证实了低频低强度超声可有效提高LEV-NPs抗菌疗效，具有显著的协同药物增效作用。另外，在治疗大鼠皮下BCG结核肉芽肿实验中，超声联合LEV-NPs组结核肉芽肿体积减小最明显，较对照组体积减小约80%，表明超声联合LEV-NPs可明显抑制结核肉芽肿生长。

前期研究［16］结果证实，超声增强纳米粒修饰的药物传递是一个复杂的过程，受各种物理参数的影响，其动力学过程复杂且激烈。在超声辐射力和声流的作用下纳米粒产生瞬态空化，提高了细胞壁通透性，从而增加药物进入MTB菌体内的浓度［17-18］，由此推测超声瞬态空化产生的临时“递药通道”为药物递送提供了快速途径。实际上这种瞬态空化是指在声波的负压半周期内空化核（微小气泡）迅速膨胀，随后又在声波正半周期内气泡被压缩以至崩溃。而纳米粒的存在更降低了这种超声瞬态空化的阈值。由此可见，超声增强载药纳米粒在促进药物进入菌体方面显示出巨大的潜力，同时利用纳米粒的药物缓释特性，可以实现抗结核药物靶向运载、持续治疗，降低游离药物毒副作用，有望缩短结核病治疗疗程，提高耐药结核病的药物治疗效果，为结核病治疗带来新的突破。

综上所述，本实验成功制备了LEV-NPs，并验证了超声介导LEV-NPs可显著提高对体内外BCG的杀菌效果，二者具有协同增效作用，为临床耐药结核病的治疗提供新的思路。