核磷蛋白1与Runt相关转录因子1基因共突变对非急性早幼粒细胞白血病型急性髓系白血病患者化疗疗效及预后的影响

刘石琳 彭栋 陈鹏 逯霞 石雨薇

急性髓系白血病(AML)发病机制与遗传基因突变密切相关。目前AML治疗仍以规范化化疗为主，但临床实践发现AML患者化疗疗效与预后复发存在较大差异[1-2]。相关临床研究结果证实，AML发生、发展及复发与某些基因突变紧密相关，其中核磷蛋白1(NPM1)与Runt相关转录因子1(RUNX1)等基因受到关注[1-3]。目前已证实，包括AML在内的多种血液系统肿瘤与NPM1及RUNX1基因突变相关，但临床研究多为探讨单基因突变与AML患者预后的相关性。近年研究发现，非急性早幼粒细胞白血病(M3)型AML患者存在NPM1与RUNX1基因共突变现象[4]。本研究主要探讨NPM1与RUNX1基因共突变与非M3型AML患者化疗疗效及预后的相关性，为临床对非M3型AML进行靶向性治疗、改善疗效及预后提供依据。

对象与方法

1.对象：纳入2017年1月～2018年12月我院收治的120例初诊非M3型AML患者，其中男68例，女52例，年龄14～66岁，中位年龄42岁。纳入标准：(1)AML诊断依据法、美、英分型系统(FAB)分型及WHO急性白血病分类及诊断标准(2016年)[4]；(2)接受骨髓细胞学检查；(3)无糖皮质激素使用史。排除标准：(1)合并肝癌、胃癌、肺癌等恶性实体肿瘤；(2)合并心、肺、肝、肾等脏器严重功能不全。根据FAB国际分型，120例患者中M1型9例、M2型58例、M4型19例、M5型27例、M6型7例。本研究已通过我院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)一般临床资料和实验室检查结果收集：包括性别、年龄、AML类型、骨髓幼稚细胞数量、初诊时的血常规结果[WBC计数、中性粒细胞 (NEU)计数、淋巴细胞(LYM)计数]。

(2)NPM1与RUNX1基因检测：①分离骨髓单个核细胞：抽取所有患者骨髓后立即放入抗凝试管中，分离白细胞，加入红细胞裂解液，混匀静置10 min，离心后吸除上清液，洗涤沉淀。②RNA提取及cDNA合成：分离的骨髓单核细胞Trizol提取液，加入氯仿150 μl，混匀，4 ℃静置5 min，离心取上清液；上清液加入异丙醇，混匀，冰浴10 min，离心洗涤3遍，保留沉淀；加75%乙醇，振荡离心2次，65 ℃烘干；加入RNase-free水溶解沉淀；紫外分光光度计对吸光度值检测，测定总RAN浓度；合成cDNA，-20 ℃保存备用。NPM1与RUNX1基因表达水平通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测，结果采用2-ΔCt表示。

(3)基因突变检测：应用基因测序仪(型号：Applied Biosystems 3130，购自美国应用生物系统公司)，通过毛细管电泳对阳性PCR产物和测序引物进行测序，运用Chromas软件分析测序结果，对NPM1与RUNX1基因的阳性PCR产物行反向引物测序进行验证。分别检测NPMI基因第12外显子基因的插入、RUNX1基因第7外显子基因的插入突变情况。根据基因突变结果将120例AML患者分为NPM1基因突变型组(33例)和NPM1基因野生型组(87例)、RUNX1基因突变型组(26例)和RUNX1基因野生型组(94例)、NPM1与RUNX1基因共突变型组(23例)和NPM1与RUNX1基因野生型组(97例)。

(4)临床化疗方案：本研究临床化疗方案为柔红霉素(DNR)+阿糖胞苷(Ara-c，DA)方案或高三尖杉酯碱(HHT )+Ara-c(HA)方案。DA方案：DNR 45 mg·m-2·d-1，连续静脉滴注3 d；Ara-c 150 mg·m-2·d-1，连续静脉滴注7 d。HA方案：HHT 2.5 mg·m-2·d-1，连续静脉滴注7 d；Ara-c 150 mg·m-2·d-1，连续静脉滴注7 d。所有患者均治疗3个疗程。

(5)疗效判断：AML患者接受3个化疗疗程后疗效判断标准[5]：①完全缓解(CR)：无贫血、出血、感染或白血病细胞浸润性表现；Hb>90 g/L，WBC计数正常或减少，无未成熟细胞，PLT计数>100×109/L；原始细胞和早期细胞骨髓中的幼稚细胞(或未成熟细胞)<5%，红细胞和巨核系正常。②部分缓解(PR)：临床、血液和骨髓三个方面中的一个或两个方面不符合CR标准；骨髓原始细胞和早期幼稚细胞< 20%。③无缓解(NR)：临床、血液和骨髓方面均未能满足CR，骨髓中原始细胞和早期幼稚细胞>20%。有效率(%)=(CR+PR)/总例数×100%。

(6)染色体核型分析：应用短期培养0.01%胰酶消化染色体G显带技术，在显微镜下观察染色体G显带核型，进行染色体分析。染色体核型按照《人类细胞遗传学国际命名体制》判定。

(7)随访：患者出院后予以门诊或电话随访，间隔时间为2个月，随访终点为出院后2年或患者死亡。记录所有患者的总生存期(OS)及并发症发生情况。

结 果

1.基因突变检测结果：120例非M3型AML患者成功完成染色体核型分析113例(正常核型51例，异常核型69例)，失败7例。共检测出NPM1基因突变33例，发生率为27.5%(33/120)； RUNX1基因突变26例，发生率为21.7%(26/120)；NPM1与RUNX1基因共突变23例，发生率为19.2%(23/120)。与正常核型患者相比，异常核型患者NPM1基因突变[15.7%(8/51) 比36.2%(25/69) ，P=0.013]与RUNX1基因突变[9.8%(5/51) 比30.4%(21/69) ，P=0.007]比例均较高。

2.不同基因表达型组非M3型AML患者一般临床资料及实验室检查结果比较：NPM1基因野生型组与NPM1基因突变型组、RUNX1基因野生型组与RUNX1基因突变型组、NPM1与RUNX1基因野生型组与NPM1与RUNX1基因突变型组患者性别、年龄、AML类型及初诊血常规中WBC、NEU、LYM计数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、2、3。

3.不同基因表达型组非M3型AML患者疗效比较：

120例患者随访时间8～24个月，中位随访时间为19个月。NPM1基因野生型组患者CR 35例，PR 33例，NR 19例，治疗有效率为78.2%(68/87)；NPM1基因突变型组患者CR 21例，PR 10例，NR 2例，治疗有效率为93.9%(31/33)；NPM1基因突变型组患者治疗有效率显著高于NPM1基因野生型组 (χ2=4.126，P=0.042)。RUNX1基因野生型组CR 30例，PR 30例，NR 37例，治疗有效率为61.9%(60/97)；RUNX1基因突变型组患者CR 14例，PR 11例，NR 1例，治疗有效率为96.1%(25/26)；两组患者治疗有效率比较差异无统计学意义 (χ2=3.475，P=0.062)。NPM1与RUNX1基因野生型组患者CR 30例，PR 30例，NR 37例，治疗有效率为61.9%(60/97)；NPM1与RUNX1基因共突变组患者CR 13例，PR 8例，NR 2例，治疗有效率为91.3%(21/23)；NPM1与RUNX1基因共突变组治疗有效率显著高于NPM1与RUNX1基因野生型组 (χ2=7.350，P=0.007)。

4.不同NPM1与RUNX1基因表达型非M3型AML患者生存分析：Kaplan-Meier生存分析结果显示，随访2年NPM1与RUNX1基因共突变患者OS长于NPM1与RUNX1基因野生型，而NPM1或RUNX1基因单突变患者OS介于前两者之间(P<0.05)。见图1。

5.影响非M3型AML患者化疗预后的因素分析：多因素logistic分析结果显示，骨髓幼稚细胞数量是非M3型AML患者化疗后2年生存率的危险因素(OR=2.017，P=0.018)，而NPM1与RUNX1基因共突变是其保护因素(OR=0.621，P=0.026)。

6.不同NPM1与RUNX1基因表达型非M3型AML患者并发症比较:NPM1与RUNX1基因共突变组与NPM1与RUNX1基因野生型组患者化疗后感染发生率[17.4%(4/23)比29.9%(29/97)，P=0.227]、复发率[13.0%(3/23) 比10.3%(10/97)，P=0.704]及髓外浸润发生率[8.7%(2/23) 比12.4%(12/97)，P=0.622]比较差异均无统计学意义。

讨 论

AML发生、发展和转归与癌基因的激活、抑癌基因的失活密切相关。相关研究证实，AML常见的分子遗传学改变是NPM1、RUNX1、FLT3、C-KIT等基因突变[6]，然而这些基因在国内外不同AML患者中总突变率存在较大差异，这也提示AML基因突变具有异质性，可能与民族、种族、地区等因素有关[7]。近年来临床认为单一基因突变可能不足以导致AML的发生、发展，患者体内应存在2个或以上基因共同突变，互相起到协同效应[8]。仅探讨单一基因突变对AML患者治疗敏感性及预后评估的临床意义有限，因此探寻能较好评估AML患者疗效及预后的常见基因共突变已成为研究热点。

NPM1基因编码的多功能磷蛋白参与核质间物质转运，促进核糖体合成，能有效保持细胞的遗传稳定性及基因组的稳定性。而携带NPM1基因突变的AML细胞多具有遗传学不稳定性，能调控AML细胞增殖和凋亡过程，同时也会伴随其他基因突变[9]。一项国外研究报道结果显示，正常核型AML患者NPM1基因突变发生率为47.4%，而在初诊AML患者中的发生率仅为20.5%～25.8%[10]，这与本研究非M3型AML患者NPM1基因突变发生率为27.5%结果一致。RUNX1基因编码蛋白具有调节造血功能作用，被认为是造血干细胞的关键调节因子之一。RUNX1基因突变会干扰造血细胞的正常分化，造成髓细胞分化延缓及造血干细胞生长发育阻滞，这也被认为是白血病前期状态。本研究发现RUNX1基因在非M3型AML患者中的总突变率为21.7%，显著高于国外研究报道[11]，其原因可能与研究人群种族差异存在一定相关性。

由于M3型AML患者的临床治疗措施与其他类型AML患者存在显著差异[12]，因此不能和其他类型AML混为一谈，故本研究纳入的研究对象排除M3型患者。本研究结果显示，非M3型AML患者的NPM1与RUNX1基因共突变发生率为19.2%，这与既往研究结果一致[3,10]。考虑本研究样本量较小，需要大样本临床研究予以验证。本研究结果表明，NPM1基因突变型组患者治疗有效率显著高于NPM1基因野生型组，提示NPM1基因突变预示非M3型AML患者化疗效果理想，较易达到CR，这与国外既往研究结果一致[13]。但本研究中RUNX1基因野生型组与RUNX1基因突变型组患者治疗有效率比较差异无统计学意义，而国外研究结果认为急性T淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征及AML等患者中，RUNX1基因突变会降低化疗耐药发生率[14]，其不同的原因还需进一步研究分析。但NPM1与RUNX1基因共突变组患者治疗有效率显著高于NPM1与RUNX1基因野生型组，且生存分析结果也证实NPM1与RUNX1基因共突变非M3型AML患者的2年预后更好。多因素logistic分析显示，NPM1与RUNX1基因共突变是非M3型AML患者预后的保护因素。在对患者化疗后随访发现，NPM1与RUNX1基因共突变组与NPM1与RUNX1基因野生型组患者的化疗后感染、复发及髓外浸润发生率比较差异均无统计学意义，提示临床可通过干预NPM1与RUNX1基因共突变，可能会对非M3型AML患者化疗疗效及预后起到改善效果。

综上所述，NPM1与RUNX1基因共突变与非M3型AML患者化疗疗效及预后均显著相关，这也为该病的诊治提供了新思路。但本研究也有不足之处，如尚未对其他常见靶基因与相关信号通路进行研究，NPM1与RUNX1基因共突变的AML患者长期预后尚不能确定，还有待进一步探讨分析NPM1与RUNX1基因共突变与其他预后因素的相关性。