核因子红细胞2相关因子2、低氧诱导因子-1α在食管鳞癌组织中的表达水平、临床意义及相关作用机制探讨

皮国良 李明 严龙君 金军

2020年全球因食管癌死亡的病例共54万，中国因食管癌死亡人数则多达30万[1]。目前因食管癌早期诊断方法有限，内镜下活检是明确诊断的主要方法。虽术后5年生存率超过95%，但是并非所有患者都能接受手术治疗[2]。食管癌主要病理类型为鳞癌和腺癌，其中食管鳞状细胞癌是我国最主要的病理类型，占90%以上。因此，研究食管癌的潜在肿瘤标志物非常重要，尤其是对于中晚期食管鳞癌患者。核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)信号通路参与癌细胞的生长和增殖，阻止肿瘤细胞的凋亡，可增强癌细胞对放化疗的耐受性。肿瘤组织中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达上调会增加Nrf2转录活性，促进细胞抗氧化蛋白表达增加，增强肿瘤细胞对放化疗的耐受能力。本文探讨Nrf2、HIF-1α在食管鳞癌中的表达，以期提高临床对食管鳞癌发生发展机制的认识，为食管鳞癌治疗提供新的靶点依据。

对象与方法

1.对象：2010年6月～2020年8月湖北省肿瘤医院病理科食管鳞癌组织及对应癌旁组织切片各34例。纳入标准：(1)切片来源患者符合食管鳞状细胞癌病理诊断，需两名高年资病理科医生确认；(2)切片为完整的癌组织及对应的癌旁组织；(3)切片来源患者均行食管癌根治术且未接受术前放化疗、免疫治疗或靶向治疗；(4)切片来源患者未合并其他恶性肿瘤；(5)患者术后均未接受进一步抗肿瘤治疗。本研究是以术后病情复发作为研究的终点，所有患者均按照美国国立综合癌症网络(NCCN)食管癌临床指南2020版进行肿瘤的TNM分期。本研究已通过湖北省肿瘤医院伦理委员会审核批准。

2.方法

(1)临床资料：收集切片来源患者的临床资料，包括性别、年龄、肿瘤部位(距离上门齿约24cm定义为上段食管癌，25～32cm定义为中段食管癌，>32cm定义为下段食管癌)、病变长度、是否侵及食管黏膜下层或固有肌层、肿瘤浸润深度(T1～T4)、淋巴结转移情况、TNM分期(Ⅰ期～Ⅳ期)及预后情况。

(2)免疫组化染色及阳性细胞检测：采用免疫组化方法同时对食管鳞癌组织及对应癌旁组织切片进行染色，显微镜下观察到细胞膜、细胞质和细胞核中呈浅黄色或棕褐色颗粒，即视为阳性细胞。对所有切片利用赛维尔图像分析系统自动读取组织测量区域，先进行染色强度值评分：无着色为阴性，计0分；淡黄色为弱阳性，计1分；棕黄色为中阳性，计2分；棕褐色为强阳性，计3分。每张切片于镜下(×40)随机观察5个视野，根据阳性细胞比率计分：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。阳性细胞比率(%)=阳性细胞数(个)/细胞总数(个)×100%。综合阳性评分(分)=染色强度值分值(分)×阳性细胞比率分值(分)。0～3分为阴性，≥4分为阳性，数值越大说明综合阳性强度越强。

(3)分组：根据食管鳞癌组织组中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2综合阳性评分结果，将34例切片分为阳性组和阴性组。根据Nrf2、HIF-1α在食管鳞癌组织中的表达情况，分别对两者表达阳性和阴性患者的预后进行分组比较。

3.统计学分析：应用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以例和百分比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。采用Spearman相关分析评价HIF-1α、E-cadherin和mdm2与Nrf2的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2免疫组化染色结果：Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2在食管鳞癌组织中均呈阳性表达，在对应癌旁组织中均呈阴性表达。见图1。

图1 食管鳞癌组织和对应癌旁组织Nrf2、HIF-1α、E-cadherin及mdm2免疫组化染色结果[A、B、C、D：癌组织，E、F、G、H：癌旁组织； A、E：Nrf2阳性及阴性表达；B、F：HIF-1α阳性及阴性表达；C、G：E-cadherin阳性及阴性表达；D、H：mdm2阳性及阴性表达；×40]

2.食管鳞癌组织Nrf2和HIF-1α表达阳性组与阴性组临床资料比较：根据Nrf2表达情况，将食管鳞癌组织切片34例分为Nrf2表达阳性组22例和阴性组12例；根据HIF-1α表达情况，将食管鳞癌组织切片34例分为HIF-1α表达阳性组25例和阴性组9例。Nrf2表达阳性组侵及食管黏膜下层或固有肌层、肿瘤浸润深度T3～T4、淋巴结转移及TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期/Ⅳ期患者比例均高于Nrf2表达阴性组(P<0.05)，两组其余临床资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。HIF-1α表达阳性组肿瘤浸润深度T3～T4、淋巴结转移及TNM分期Ⅱ期、Ⅲ期/Ⅳ期患者比例均高于HIF-1α表达阴性组(P<0.05)，两组其余临床资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 食管鳞癌组织Nrf2表达阳性组与阴性组患者临床资料比较[例(%)]

表2 食管鳞癌组织HIF-1α表达阳性组与阴性组患者临床资料比较[例(%)]

3.食管鳞癌组织组及癌旁组织组中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin、mdm2表达阳性率比较：Nrf2、HIF-1α及mdm2在食管鳞癌组织组中表达阳性率均显著高于癌旁组织组(P<0.05)，E-cadherin在食管鳞癌组织组中表达阳性率显著低于癌旁组织组(P<0.05)。见表3。

表3 食管鳞癌组织组及癌旁组织组中Nrf2、HIF-1α、E-cadherin、mdm2表达的阳性率比较[例，(%)]

4.Nrf2与HIF-1α、E-cadherin及mdm2表达的相关性：Spearman相关分析结果显示，Nrf2在食管鳞癌组织中的表达水平与HIF-1α的表达水平呈正相关(r=0.435，P=0.007)，与E-cadherin(r=0.235，P=0.042)及mdm2(r=0.331，P=0.007)均呈负相关。

5.食管鳞癌不同组别患者预后比较：Nrf2阳性组患者术后无进展生存期(PFS)与阴性组比较差异无统计学意义[(36±3.9)个月比(38±3.3)个月,P>0.05]。HIF-1α阳性组患者术后PFS与阴性组比较差异无统计学意义[(36±2.3)个月比(43±1.8)个月，P>0.05]。Nrf2和HIF-1α全阳组患者术后PFS与非Nrf2和HIF-1α全阳组比较差异无统计学意义[(38±3.2)个月比(41±4.2)个月，P>0.05]。

讨 论

有研究显示，Ⅲ期食管癌患者经手术及术后放化疗等综合治疗后5年生存率较前有所提高，但若食管癌早期及时干预，5年生存率可达90%左右[3]。早发现、早诊断、早治疗才是食管癌防治及提高食管癌生存率的有效手段。肿瘤异质性通常是由多种病理机制诱发而成，不同的病理机制中总有某一个或几个因子起着关键作用。这些关键因子一旦功能失衡，则将通过信号通路产生级联放大效应，最终通过细胞异常的生物功能表现出来[4]。

Nrf2是Capncollar(CNC)转录因子的成员，分子量为66 kDa并由7个Neh域组成[5]。Nrf2的正常生理功能是维持细胞的氧化还原稳态进而发挥抗炎及抗癌活性，正常情况下呈低表达状态。但多项研究发现肿瘤组织中Nrf2异常高表达，Nrf2的异常表达促进癌细胞生长，介导癌细胞对放化疗的抗性，保护肿瘤细胞使其免于凋亡和衰老等[6]。Nrf2在多种肿瘤组织中均有研究，大多数呈高表达状态，但尚未得到统一的结论。Nrf2在人舌鳞癌和胃癌组织中高表达，致使Nrf2-Keap1结合不稳定，Nrf2游离出来并转移到细胞核，通过结合ARE激活下游转录基因，进而影响肿瘤进展[7-8]。既往研究结果显示，宫颈鳞癌组织中Nrf2信号通路与Wnt信号通路之间存在某种平衡关系[9]。Nrf2在肿瘤组织中的表达并非总是上调，在皮肤鳞癌组织中呈现低表达或无表达的状态。本研究发现，Nrf2在食管鳞癌组织中高表达并与食管鳞癌浸润的深度、T分期、淋巴结转移及TNM分期密切相关，但是生存曲线提示Nrf2表达对患者生存预后的影响不大，可能需要大样本临床试验证实。

HIF-1是细胞在缺氧状态进行适应性调节的一种关键转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成[10-11]。有研究发现利用RNA沉默HIF-1α会导致基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达下调并抑制胃癌细胞的局部浸润[12-13]。本试验中HIF-1α在食管鳞癌组织中高表达，其阳性率(73.53%)显著高于癌旁组织(44.12%)。结合HIF-1α与临床病理因素的相关性分析，我们发现食管鳞癌组织中HIF-1α的表达与T分期、淋巴结转移及TNM分期密切相关。随着食管癌患者病情进展、局部浸润及淋巴结远处转移的增加，HIF-1α呈现明显高表达，这也符合肿瘤组织过度生长引发局部缺氧的生物学特性。结合HIF-1α对预后的影响，进一步证实HIF-1α的高表达能促进肿瘤的发生发展，与既往研究结果一致[14]。

本研究中，E-cadherin在食管鳞癌组织中表达的阳性率明显低于癌旁组织，mdm2与之相反，与既往研究结果一致[15-16]。Spearman相关分析结果显示，Nrf2在食管鳞癌组织中的表达水平与HIF-1α的表达水平呈正相关，与E-cadherin及mdm2均呈负相关。因此，我们推测食管鳞癌的进展与Nrf2/HIF-1α信号通路密切相关，活化的Nrf2/HIF-1α信号通路可能通过抑制E-cadherin并同时促进mdm2的表达参与食管鳞癌的进展。在接下来的研究中，我们将继续完善Nrf2和HIF-1α相关食管鳞癌细胞系生物学活性的检测，以探究Nrf2和HIF-1α在食管鳞癌进展过程中的作用机制。本研究样本量较小，期待循证医学大样本数据以获得更加准确的结果。

综上所述，Nrf2/HIF-1α信号通路在食管鳞癌中呈活化的状态并可能通过下调E-cad-herin和上调mdm2的表达参与食管鳞癌的发生发展，Nrf2可能为食管鳞癌治疗提供新的靶点。