传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

于 雷，潘 雨，高 洁，迟 鑫，刘 硕

(北京中海生物科技有限公司，北京 100081)

传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一种危害青年鸡的烈性、高度接触性的病毒病[1]，1957年首次出现于美国[2]。我国自1979年发现该病以来[3]，全国各地陆续有该病发生和流行的报道。

IBDV属于双RNA病毒科，其基因组由A、B两节段组成，编码5种蛋白，分别为VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[4]。其中VP2是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原，还与病毒毒力、抗原变异及细胞凋亡等有关[5]。目前已把VP2作为基因工程亚单位疫苗的主要目的基因进行研究。

依据致病性和抗原性的差异，血清Ⅰ型IBDV野毒株可分为经典毒株、变异毒株和超强毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)[6]。自1990年以来，我国和其它国家及地区不断分离到vvIBDV，它能突破由经典毒株致弱的活疫苗或灭活疫苗提供的保护作用，导致雏鸡发病[7]。vvIBDV的高致死率给养禽业造成了巨大经济损失[8]。

山东某肉鸡场在B87活疫苗免疫后仍发生疑似传染性法氏囊病的病例。从发病死亡的鸡只上采集病料组织，进行病毒分离鉴定，分离到一株vvIBDV，对VP2基因进行了克隆和序列分析，从分子水平研究其毒力和基因变异情况，并对其致病性等进行了研究，解释免疫鸡群发病的原因，以期为该病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料 采自山东某817肉鸡场疑似法氏囊病的病鸡法氏囊组织。

1.2 SPF鸡胚和SPF鸡 购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.3 标准品 IBDV阳性血清、IBDV琼扩抗原等由北京中海生物科技有限公司提供。

1.4 主要试剂及试剂盒 病毒核酸提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、DNA凝胶回收提取试剂盒、pEASY©-T1 Cloning Kit等均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.5 引物设计与合成 VP2基因扩增引物参照文献[9]，上游引物为5′-CGAATTCATGACAAACCTGCAAGAT-3′，下游引物为5′-CCGCTCGAGTCACCTTAGGGCCCGGATTAT-3′。由北京三博远志生物技术有限公司合成。

1.6 病料处理 采集出现典型症状和病理变化的病死鸡法氏囊组织。将法氏囊组织剪碎，称重后按照1∶5比例(m/V)加入灭菌生理盐水(加入终浓度为2000 单位/mL的青、链霉素)，放入研磨器中研磨，得到匀浆液；冻融3次；加入等体积氯仿，低温振荡作用过夜；4 ℃、10000 g离心5 min，取上清液。-70 ℃冷冻保存备用。

1.7 病毒分离 将上清液点眼接种4周龄SPF鸡5只，0.1 mL/只。接种后每天观察，死鸡随时剖检，无菌采集法氏囊；接种后96 h剖检存活鸡，收集病变法氏囊。法氏囊组织按照1∶5比例(m/V)加入灭菌生理盐水研磨，冻融3次后10000 g离心5 min，取上清液作为试验用毒种，-70 ℃冷冻保存备用。

1.8 琼脂扩散试验(AGP) 按常规方法进行：琼脂板用梅花打孔器打孔，中间孔加入IBDV阳性血清，周围孔分别加入分离株病毒液、标准IBDV琼扩抗原及生理盐水对照，37 ℃湿盒中孵育36 h，观察结果。

1.9 病毒RNA的提取 试验用毒种融化后用试剂盒提取病毒RNA。

1.10 VP2基因扩增及克隆与测序 以提取的病毒RNA为模板，通过下游引物进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，通过上、下游引物，经PCR扩增VP2基因。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因，与pEASY©-T1载体连接后转化Trans 5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒，送北京三博远志生物技术有限公司测序。

1.11 VP2基因的序列分析 利用DNAStar软件对分离株及GenBank上其他毒株(表1)的VP2基因进行核苷酸序列和氨基酸序列比对，采用MEGA软件中Neighbor-Joining(NJ)方法进行遗传演化分析，并绘制系统进化树。

表1 IBDV参考毒株信息Tab 1 Information of reference IBDV strains

1.12 鸡胚半数致死量(ELD50)的测定 试验用毒种用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释，取10-2～10-6共5个稀释度，每稀释度经绒毛尿囊膜途径接种鸡胚5枚，0.2 mL/枚，置37 ℃孵育168 h，记录各组鸡胚死亡情况及胚体病变，根据Reed-Muench法计算ELD50。

1.13 外源病毒检验 用灭菌生理盐水将试验用毒种稀释至103.5ELD50/0.1 ml，与等量鸡传染性法氏囊病阳性血清混合，37 ℃作用60 min。按照《中国兽药典》2020年版三部附录3505外源病毒检验法中“1 禽源制品及其细胞的检验”[10]中“1.2 鸡胚检查法”和“1.3 细胞检查法”进行。

1.14 致病性试验 用4周龄SPF鸡15只，随机分成2组，第1组10只，各点眼接种试验用毒种104.0ELD50(0.1 mL)；第2组5只，不接种作为对照。两组鸡在相同条件下隔离饲养，连续观察96 h，观察各组鸡临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离与鉴定 IBDV病料接种SPF鸡进行病毒分离，96 h内死亡3只，剖检可见法氏囊充血，肿胀，外观似紫葡萄样；2只存活鸡96 h时精神沉郁，羽毛蓬松，剖检法氏囊出现胶冻样肿胀。无菌采集所有鸡只法氏囊，经处理后作为试验用毒种。对其进行RT-PCR检测和琼脂扩散试验，核酸电泳后出现一条约1400 bp的条带，与预期大小相符(图1)；琼脂扩散试验中，待检毒种与阳性血清孔间出现了一条乳白色沉淀线，与标准IBDV琼扩抗原阳性对照相同，而生理盐水阴性对照无沉淀，结果表明IBDV阳性。将该IBDV分离株命名为ZHA001株。

图1 RT-PCR扩增VP2基因Fig 1 Amplification of VP2gene with PT-PCR

2.2 序列测定结果及同源性分析 测序结果表明，ZHA001株VP2基因大小为1356 bp，编码452个氨基酸。利用DNAStar软件对该毒株及血清I型参考毒株的VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果显示，ZHA001株与其他IBDV毒株的核苷酸同源性超过90.1%，其中与超强毒株UK661和OKYM株的同源性为97.9%，与超强毒株HLJ19-6101株的同源性最高，为99.1%；与超强毒株氨基酸序列的同源性均大于99 %。

2.3 ZHA001株VP2高变区氨基酸分析 对ZHA001株VP2高变区的氨基酸进行分析，与参考毒株的特征性氨基酸位点进行比较，发现ZHA001株与超强毒特征性氨基酸位点相一致(表2)，七肽区(326～332)也与超强毒株完全相同，为“SWSASGS”。

表2 IBDV VP2基因高变区氨基酸比对结果Tab 2 The amino acid alignment of IBDV VP2 gene hypervariable region

2.4 遗传进化分析 基于VP2基因的核苷酸序列遗传进化树显示，血清I型的IBDV毒株可分为经典毒株、超强毒株、弱毒株和变异毒株等不同分支；IBDV ZHA001株与超强毒株(UK661、OKYM、Gx、HK46、D6948、HLJ19-6101、HB20-4401、SH95等)在同一进化树分支(图2)。

图2 ZHA001株VP2基因进化树分析Fig 2 Phylogenetic analysis of ZHA001 based on VP2

2.5 鸡胚半数致死量测定 将试验用毒种系列稀释后接种10日龄鸡胚，根据接种后鸡胚的死亡情况，计算出ZHA001株的ELD50为10-4.38/0.2 mL。死胚表现为绒毛尿囊膜增厚，胚体水肿、脑部充血，剖检可见肝脏斑驳状病变。

2.6 外源病毒检验 试验用毒种与特异性阳性血清中和后接种SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞，培养后进行判定。结果，鸡胚检查法中两种途径接种的鸡胚胎儿均发育正常，绒毛尿囊膜无病变，取接种鸡胚的鸡胚液进行红细胞凝集试验，结果均为阴性；细胞检查法中，接种的细胞无细胞病变，对细胞进行红细胞吸附试验，未出现红细胞吸附现象。上述结果表明该试验毒种无外源病毒污染，毒种纯净。

2.7 毒力试验 IBDV ZHA001株接种SPF鸡后36 h，部分鸡只精神沉郁，拉白色或绿色稀便。48 h，所有接种鸡精神沉郁，羽毛蓬松。48～96 h内死亡9只，剖检见法氏囊呈紫葡萄样(图3A)。1只鸡濒死，剖检法氏囊出现充血、肿胀。非接种对照组5只鸡均健活，剖检法氏囊无异常(图3B)。结果表明ZHA001株为超强毒株。

图3 ZHA001株致病性试验Fig 3 Challenge test of IBDV ZHA001

3 讨论与小结

传染性法氏囊病病毒主要侵害鸡，尤其是超强毒株，自20世纪90年代以来对我国养禽业造成重大经济损失。然而，随着饲养环境的改善和疫苗的广泛应用，超强毒株得到了很好的控制，仅呈现点发[11]。2017年以来不同于早期变异株的新型法氏囊变异株在国内开始流行[12-13]，且流行范围仍在扩大[6]。本次超强毒株的分离，也表明了目前新型变异毒株流行的同时超强毒株并未消失。

目前对IBDV 分子流行病学研究集中在该病毒VP2 基因的高变区，VP2 基因与病毒中和抗体的诱导、抗原的变异以及毒力有关[14]，VP2高变区氨基酸变化较大，因此对该区域的分子特征进行研究不仅可以发现IBDV的抗原性变化，还可提供IBDV毒株遗传进化信息。本研究克隆了IBDV ZHA001株VP2基因，并对其与NCBI上其他IBDV毒株进行比较分析。结果表明，分离毒株与其他IBDV 超强毒株的核苷酸相似性均超过97.6%，氨基酸相似性均超过99.3%，并且具有222A、242I、279D、256I、284A、294I和299S等超强毒株特征性氨基酸[15-17]，从分子水平说明ZHA001株为IBDV 超强毒株；从进化树也可以看出，ZHA001株与8个超强毒的参考毒株位于同一个大的分支。致病性试验中，SPF鸡感染率10/10，死亡率9/10，符合超强毒株特性[18]，与VP2基因序列分析和进化树分析一致。

分离ZHA001株的养鸡场在发生IBD前免疫过B87活疫苗，如果不是免疫失误，那么可能是超强毒突破疫苗保护所致，因为IBDV超强毒株能够突破高水平抗体的保护，导致鸡群高死亡率[1]。当然也不排除与抗原变异有关，ZHA001株VP2第212位氨基酸(D→N)、384位氨基酸(V→I)发生改变，尤其第212位氨基酸位于VP2的第一亲水区(212 ～224AA)，该区域氨基酸的改变可能引起VP2抗原性改变，造成抗原变异。这种改变是否会造成抗原的剧烈改变还需进一步研究。

本次从免疫传染性法氏囊病活疫苗的发病肉鸡群分离到一株IBDV，命名为ZHA001株，经鉴定为超强毒株。本研究可为传染性法氏囊病的防控提供参考。