基于网络药理学探讨马针颗粒治疗仔猪腹泻的作用机制

曲雪嘉，李涪锌，王春花

(牡丹江师范学院生命科学学院，黑龙江牡丹江 157000)

仔猪腹泻为规模化养殖场断奶仔猪最常见疾病。产肠毒素大肠杆菌是早期断奶仔猪腹泻高发的重要诱因之一，由于药物的不规范使用，导致临床上的大肠杆菌普遍耐药。中药具有低毒低耐药等特点，马针颗粒由马齿苋、三颗针两味中药组成，为我国三类新兽药，临床研究发现马针颗粒对仔猪黄、白痢治愈率高达100%[1-3]，但其药效成分与作用机制目前并不十分清楚。

中药成分多而复杂，网络药理学技术为中药研究的难点与瓶颈问题提供了新的思路与方法[4-8]。网络药理学是以系统生物学和多向药理学理论为基础，采用生物分子网络分析的方法，为中医药治疗疾病机理的研究与阐述提供了新途径。它突破传统的“一个基因一个药物一个疾病”理念，从系统层面揭示中药对机体调控网络作用[9-10]。目前，网络药理学技术在中兽药与中药功能性饲料添加剂领域的应用还处于初始阶段，值得深入探索，具有可观的应用前景。本研究基于网络药理学技术，通过对马针颗粒成分、靶点、生物功能、调控通路与靶点器官定位分析，探讨马针颗粒防控仔猪腹泻的药效物质基础与作用机制，为马针颗粒治疗仔猪腹泻机制的揭示及拓展应用范围奠定基础。

1 材料与方法

1.1 马针颗粒活性化合物构建靶点网络 利用TCMSP(http:∥tcmsp-e.com)、Drugbank(https:∥www.drug bank.ca)数据库进行检索与收集马齿苋与三颗针的化合物与靶点，依据Degree≥10靶点选取，应用Cytoscape3.7.1软件构建化合物-靶点网络，确定马针颗粒的关键化合物与靶点。

1.2 马针颗粒靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 马针颗粒靶点利用STRING数据库(https:∥string-db.org)，物种选择“sus scrofa”，打分值设置>0.9，进行分析马针颗粒与仔猪腹泻靶点间关系，删除单个或无关的靶点后，应用Cytoscape3.7.1软件构建PPI网络，确定马针颗粒治疗猪腹泻的重要靶点。

1.3 马针颗粒靶点器官定位 通过BIOGPS数据库(http:∥biogps.org/#goto=welcome)对马针颗粒重要靶点(Degree值≥10)进行定位分析，保留基因表达量排名前3位的组织与器官，应用Cytoscape3.7.1构建马针颗粒核心靶点-定位网络。

1.4 马针颗粒靶点GO富集及靶点KEGG通路富集分析 马针颗粒靶点上传到DAVID数据库(http：∥david.ncifcrf.gov)，限定物种为“sus scrofa”，设定阈值P<0.05，进行GO(Gene ontology)生物学过程和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢通路富集分析，构建靶点-信号通路网络，分析马针颗粒治疗猪腹泻的调控通路。

2 结果与分析

2.1 马针颗粒化合物-靶点相互作用网络 见图1。通过TCMSP、Drugbank数据库收集、并去除无靶点化合物后收集到的18个马针颗粒的化合物和423个作用靶点。马针颗粒化合物-靶点网络共包含441个节点，214条边，平均每个化合物有23.5个靶点，根据化合物Degree值排名前5的成分主要为异甜菜甙(isobetanin_qt)、异甜菜素(isobetanidin)、花生四烯酸(arachidonic acid)、β-胡萝卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)，Degree值≥30的化合物为马针颗粒关键成分(表1)。Degree值≥10的靶点为马齿苋-三颗针关键靶点(表2)，根据靶点Degree值排名前5个关键靶点分别为溶解酵素(lysozyme)、CA2蛋白酶(Carbonic anhydrase 2)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶pim-1(Proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Pim-1)、载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)、视紫红质(rhodopsin)。

箭形节点代表靶点，圆形节点代表马针颗粒组方中药化合物，箭形节点大小与Degree成正比，圆形节点颜色深浅(由红到黄)与Degree值成正比图1 化合物-靶点网络图Fig 1 Compound target network diagram

表1 马针颗粒度值≥30的活性化合物基本信息Tab 1 Basic information of active compounds with particle size value ≥30 of Ma Zhen Granule

2.2 马针颗粒-猪腹泻靶点蛋白PPI网络 如图2所示，PPI网络马针颗粒作用靶点与19个腹泻靶点直接相关，其中包括TP53(肿瘤蛋白53)、MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3)、MAPK1(丝裂原活化蛋白激酶1)、STAT1(信号转导和转录激活子1)与NFKB1(核因子κB亚基1)5个猪腹泻与马针颗粒共有靶点。根据Degree值大小排名TP53、TNF(肿瘤坏死因子)、JUN(jun原癌基因)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)、MAPK14(丝裂原活化蛋白激酶14)、MAPK3、MAPK1、PPARG(过氧化物酶体增生激活受体γ)、MYC(myc癌基因)等，与猪腹泻靶点相互关系最紧密，为马针颗粒治疗猪腹泻的重要靶点(Degree>65)。

表2 马针颗粒度值≥10的靶点基本信息Tab 2 Basic information of the target of Ma Zhen Granule equine needle particle size value ≥10

图左侧为仔猪腹泻靶点，右侧为马针颗粒化合物靶点，中间为仔猪腹泻与化合物的共同靶点，节点大小、颜色深浅(由红到黄)与Degree值成正比图2 马针颗粒-关键靶点-疾病网络Fig 2 Ma Zhen Granule -key target-disease network

2.3 靶点定位分析与归经理论的相关性分析 如图3所示，马针颗粒重要靶点主要分布在空肠(Jejunum，Degree=6)，巨噬细胞(Macrophage，Degree=6)，骨髓(Marrow，Degree=5)，回肠(lleum，Degree值=4)，胸腺(Thymus，Degree=3)，十二指肠(Duodenum，Degree=2)，说明马针颗粒在肠道、免疫功能中具有重要作用，这也马针颗粒具有较好的仔猪腹泻治疗作用的主要原因。另外，马针颗粒重要靶点在卵巢(Ovary，Degree=5)，胎盘(Placenta，Degree=3)，子宫(Uterus，Degree=2)的分布也较多，推测马针颗粒可能在妊娠母猪应用中具有一定风险，具体具有何种风险能否应用于妊娠母猪值得进一步研究。

图中橘色节点代表马针颗粒重要靶点，紫色、绿色、湖蓝色、深蓝色、黄色节点代表各类组织器官图3 马针颗粒靶点-归经网络Fig 3 Target meridian network of Ma Zhen Granule

2.4 靶点通路分析 将马针颗粒调控猪腹泻的核心靶点蛋白输入DAVID数据库，GO功能富集分析得到GO条目114个(P<0.05)，其中生物过程(BP)条目75个，占总比例的66%，分子功能(CC)条目16个，占14%，细胞组成(MF)相关条目23个，占20%，主要条目如图4所示。

图4 马针颗粒靶点GO富集Fig 4 GO enrichment at Ma Zhen Granule targets

KEGG通路注释分析，发现信号通路282条(P<0.05)，按P值排在前15的信号通路(图5)包括Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、TNF信号通路(tumor necrosis factor signaling pathway)两个重要炎性反应信号调控通路，其中靶点MAPK3、MAPK10、MAPK8等在通路中出现的次数较多。另外，MAPK3为马针颗粒与猪腹泻共有靶点，在马针颗粒治疗仔猪腹泻靶点与机制研究中值得重点关注。

图5 马针颗粒靶点KEGG通路Fig 5 KEGG pathway of Ma Zhen Granule target

3 讨 论

近些年，防控仔猪腹泻的替抗产品研究主要集中在益生菌、有机酸、酶制剂、植物提取物、发酵饲料、中短链脂肪酸以及低蛋白质饲粮[9]。这些产品多以改善断奶仔猪肠道健康为目的，具有提高生产性能、降低腹泻率的作用，文献显示植物提取物降低腹泻率优于其他替抗物质，更接近抗生素的防控腹泻效果[10]，这可能与一些植物提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等多重功效有关[10-12]。中药具有多成分多靶点，防控猪腹泻同时还可改善脾胃功能、提高仔猪生长性能，是其他类型替抗产品无法替代的，在防控仔猪腹泻特别是ETEC导致的断奶仔猪腹泻中应更具有前景性[13]。马针颗粒是由马齿苋和三颗针组成的中药制剂，为我国三类新兽药，在防治仔猪黄、白痢中具有显著疗效[1-3]，本研究基于网络药理学技术，通过虚拟筛选确定马针颗粒的核心化合物与作用靶点，进一步探讨了马针颗粒核心化合物对仔猪腹泻的调控机制。

马针颗粒核心化合物异甜菜甙、异甜菜素、花生四烯酸、β-胡萝卜素、槲皮素具有抗炎、抗菌、抗病毒与调节免疫系统作用，是马针颗粒防治猪腹泻性疾病的重要物质基础。研究显示，槲皮素具有广泛的抗病毒抗菌作用，对流行性猪腹泻病毒PEDV 3CLpro有抑制作用[14]，可提高肠道细胞Occludin和ZO-1 mRNA水平。饲料中添加槲皮素可改善肥育猪的猪肉品质以及提高抗病力肥育猪，还可促进畜禽饲料利用率，提高仔猪生长性能[14]。花生四烯酸在免疫细胞的磷脂中含量较高，代谢物PGE、PGI2和LTs为治疗炎症感染的重要因子，其代谢物中前列腺素D2和脂氧素B2浓度增高可进一步抑制炎症反应[15-16]。β-胡萝卜素能抑制炎症因子IL-18、IL-6、TNF-α等信号传导，在炎症修复中发挥重要作用[17]。

通过化合物-靶点分析发现马针颗粒关键靶点与炎症等疾病相关，其重要靶点TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等与脂多糖引起的炎性反应过程、蛋白转运、腺苷酸环化酶调控、细胞凋亡有关。TP53可通过调节细胞周期、凋亡、DNA修复和代谢变化相关基因的表达参与应激诱导反应[18]。TP53与结肠粘膜炎症密切相关，TP53降低可导致凋亡前基因Casp3活性的增加[19]。CASP3是Caspase依赖途径中凋亡的执行者[20]，与仔猪营养吸收与肠道损伤的发生有关。ETEC感染会导致仔猪空肠中CASP3激活与细胞凋亡显著增加[21]，CASP3激活可抑制脂肪酸在肠内的吸收，其机制可能与CD36和FATP4基因有关[22]。TNF在机体自稳、防御反应中发挥重要作用，研究显示粘膜炎症水平与组织TNF水平呈正相关，TNF针对性治疗手段常被用于治疗炎症性肠病[23]。MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)、MAPK14(p38MAPK)为MAPK信号通路重要成员，在胃肠道的发生发展、免疫性炎症异常激活中起着至关重要的作用[24-26]。研究显示，ERK1/ERK2和p38MAPK与IBD引起的肠粘膜损伤密切相关，ERK1/ERK2表达增加可以减少肠道炎症和上皮细胞凋亡[27]。KEGG分析发现这些核心靶点主要富集于肿瘤坏死因子信号途径(TNF signaling pathway)、Toll样受体信号途径(Toll like receptor signaling pathway)等炎性反应与免疫调控相关信号通路，说明马针颗粒干预猪腹泻过程可能与介导TNF、TLR信号通路调控炎性反应与免疫过程有关，作用CASP3靶点结果为马针颗粒应用与研究提高猪生长性能提供基础与方向，值得进一步研究确认。通过靶点定位得到马针颗粒靶点主要分布在肠道与免疫系统中，这可能是马针颗粒在防治仔猪腹泻具有显著疗效的重要原因。

综上所述，马针颗粒防治仔猪腹泻作用与异甜菜甙、异甜菜素、花生四烯酸、β-胡萝卜素、槲皮素等化合物作用于TP53、TNF、JUN、CASP3、MAPK14、MAPK3、MAPK1等核心靶点，调控TNF、TLR等炎性反应通路抑制或减轻炎症有关。