HPLC法同时测定双葛止泻口服液中绿原酸和葛根素的含量

周 冰，李焕娟，陈帅韬，安卓睿，程婵婵，姚路路，张 聪

(国家兽用药品工程技术研究中心/洛阳惠中兽药有限公司，河南洛阳 471000)

双葛止泻口服液是由金银花、葛根、黄芩、黄连等6味中药采用提取、纯化等工艺制成的复方口服液体制剂，并获得国家三类新兽药证书(农业农村部公告第186号)[1]。该产品具有清热燥湿，解毒止泻的功能，临床上主要用于仔猪湿热泄泻，证见黄色糊状或稀粥样粪便、或挟有粘液，鼻盘微干等。方中金银花清热解毒，散热疏风[2]，同时具有较强抗菌活性[3]，葛根解肌退热，升阳止泻，二者共为君药，绿原酸和葛根素则分别为两者的特征性有效成分[4-6]。现有质量标准及文献报道[7-8]中绿原酸和葛根素分别采用单独的液相条件进行检测，检测时间较长。为进一步提升检验效率，并减少有机试剂的用量，本文建立了同时测定双葛止泻口服液中绿原酸和葛根素含量的方法，并对该方法进行了方法学验证。结果表明，该方法快速、准确、专属性强，可用于双葛止泻口服液的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 U3000型高效液相色谱仪，配VWD-3400RS型紫外检测器，Thermo公司；XSR205型电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司。

1.1.2 试药与试剂 绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-202018，含量：96.1%)、葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110752-201816，含量：95.4%)、双葛止泻口服液(洛阳惠中兽药有限公司，批号：20200905，20201002，20210301)；乙腈，Thermo Fisher Scientific公司，HPLC级；磷酸，天津市科密欧化学试剂有限公司，HPLC级；水为实验室自制超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脱，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(0～14 min，乙腈11%；14～15 min，乙腈由11%上升到70%；15～20 min，乙腈70%；20～21 min，乙腈由70%下降到11%；21～25 min，乙腈11%)，流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：315 nm；进样量：10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000；按葛根素峰计算应不低于10000。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1 mL约含绿原酸40 μg、葛根素120 μg的溶液，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品2 mL，置50 mL量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方制备缺金银花的阴性样品和缺葛根的阴性样品，分别按照“1.2.3”项下方法制成阴性对照溶液，即得。

1.3 方法学考察

1.3.1 专属性试验 分别取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，考察主峰位置是否有干扰。

1.3.2 线性试验 精密称取绿原酸对照品10.72 mg，置25 ml量瓶中，作为绿原酸线性贮备液；精密称取葛根素对照品30.09 mg，置50 ml量瓶中，作为葛根素线性贮备液。分别精密量取上述贮备液按照一定比例稀释成一系列梯度浓度的混合标准工作液，绿原酸浓度分别为0.008242 mg/mL、0.02060 mg/mL、0.04121 mg/mL、0.08242 mg/mL、0.1030 mg/mL，葛根素浓度分别为0.02296 mg/mL、0.05741 mg/mL、0.1148 mg/mL、0.2296 mg/mL、0.2871 mg/mL。依次吸取上述线性溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度为(X，mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

1.3.3 精密度试验 取“1.2.2”项下对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积并计算RSD。

1.3.4 溶液稳定性试验 精密量取本品2 mL(批号：20200905)，按照“1.2.3”项制备供试品溶液，取对照品溶液和供试品溶液分别于第0、2、4、8、12小时进样，测定峰面积并计算RSD。

1.3.5 重复性试验 取同一批样品(批号：20200905)，按照“1.2.3”项下制备6份供试品溶液，依法测定，记录峰面积，计算含量及RSD。

1.3.6 中间精密度 取同一批样品(批号：20200905)，由两名人员在不同日期、使用不同的高效液相色谱仪，依法测定，每人平行测定6份。计算两人12个含量结果的RSD。

1.3.7 加样回收率 精密量取本品1 mL，共9份，分别置于50 mL量瓶中。分别精密加入相当于测定量50%水平(0.1126 mg/mL，5 mL)、100%水平(0.1126 mg/mL，10 mL)、150%水平(0.1126 mg/mL，15 mL)的绿原酸对照品溶液和相当于测定量50%水平(0.3462 mg/mL，5 mL)、100%水平(0.3462 mg/mL，10 mL)、150%水平(0.3462 mg/mL，15 mL)的葛根素对照品溶液，分别加10%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，作为回收率供试品溶液，每个水平制备3份。精密吸取对照品溶液、回收率供试品溶液各10 μL，依法测定，计算回收率及RSD。

1.3.8 耐用性 分别考察柱温、流速、磷酸比例、流动相比例及色谱柱批号变化对含量测定结果的影响。待系统稳定后，依次精密吸取对照品溶液、供试品溶液，依法进样测定。以含量及RSD为指标，考察色谱条件的耐用性。

1.4 样品测定 分别采用现有标准方法(农业农村部公告第186号)和新建立的方法对市售3批双葛止泻口服液进行含量测定，考察本文所建立方法与标准方法检测结果的差异。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

2.1.1 专属性考察结果 专属性结果表明，在缺金银花的阴性对照和缺葛根的阴性对照色谱图中，绿原酸和葛根素主峰位置均没有干扰，表明本方法专属性良好。见图1。

a. 对照品 b. 供试品 c. 阴性对照(缺葛根) d. 阴性对照(缺金银花)a. Reference Substance b. Test sample c. negative control(lack of Puerariae lobatae radix)d. negative control(lack of Lonicerae japonicae flos)图1 专属性考察色谱图Fig 1 The chromatogram of specific inspection

2.1.2 线性试验 以峰面积(Y)为纵坐标，浓度为(X，mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。绿原酸回归方程为：Y=473.8194X+0.0536(r=1.0000)；葛根素回归方程为：Y= 214.6356X+ 0.1281(r= 1.0000)。表明绿原酸进样浓度在0.008242～0.1030 mg/mL范围内和葛根素进样浓度在0.02296～0.2871 mg/mL范围内，峰面积与进样浓度线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 取“1.2.2”项下对照品溶液，连续进样6针，记录峰面积，结果绿原酸峰面积的RSD为0.1%(n=6)，葛根素峰面积的RSD为0.1%(n=6)，表明仪器精密度良好。

图2 线性关系图Fig 2 The chromatogram of linear relationship results

2.1.4 溶液稳定性试验 取对照品溶液和供试品溶液，分别于第0、2、4、8、12小时进样测定，结果对照品溶液中绿原酸峰面积的RSD为0.3%，葛根素峰面积的RSD为0.1%；供试品溶液中绿原酸峰面积的RSD为0.4%，葛根素峰面积的RSD为0.2%，表明对照品溶液和供试品溶液在12小时内稳定。

2.1.5 重复性试验 同一批样品，制备6份供试品溶液，依法测定，绿原酸平均含量为1.2 mg/mL(n= 6)，RSD为1.7%，葛根素平均含量为3.3 mg/mL(n=6)，RSD为1.9%，表明本方法重复性良好。

表1 重复性试验结果(n=6)Tab 1 The results of repeatable test results (n=6)

2.1.6 中间精密度 两名人员在不同日期、使用不同仪器测得绿原酸的平均含量为1.2 mg/mL(n=12)，RSD为1.4%，葛根素平均含量为3.3 mg/mL(n=12)，RSD为1.5%，表明本方法的中间精密度良好。

表2 中间精密度试验结果Tab 2 The results of intermediate precision test

2.1.7 加样回收率试验 通过设计3个加入水平，9份回收率结果进行评价。结果绿原酸回收率在96.35% ～ 101.24%之间，平均值为99.1%(n=9)，RSD为1.8%，葛根素回收率在96.40%～101.77%之间，平均值为98.7%(n = 9)，RSD为1.6%，表明本方法准确度良好。

表3 绿原酸回收率试验结果Tab 3 The results of Chlorogenic Acid recovery test

表4 葛根素回收率试验结果Tab 4 The results of Puerarin recovery test

2.1.8 耐用性试验 当流动相比例、柱温、流速、磷酸含量及色谱柱批号发生变化时，各因素下含量测定结果的RSD均≤ 2.0%。色谱条件的微小变化对含量测定结果无显著影响，表明本方法耐用性良好。

表5 耐用性试验结果Tab 5 The results of durability test

2.2 样品含量测定 取双葛止泻口服液样品(批号：20200905，20201002，20210301)，分别采用现有标准方法及新建立的方法测定绿原酸和葛根素的含量，两种方法检测结果无明显差异，结果见表6。

表6 样品含量测定结果Tab 6 The results of sample content determination

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择 采用紫外全波长扫描，绿原酸在327 nm处有最大吸收，葛根素在250 nm处有最大吸收，见图3。考虑到本品中葛根素含量高于绿原酸含量，为了使色谱图中绿原酸和葛根素峰面积大小一致，综合考虑，选择315 nm作为检测波长。

图3 绿原酸和葛根素光谱图Fig 3 The spectrogram of Chlorogenic Acid and Puerarin

3.2 流动相的考察 参考相关文献方法[9]，以乙腈- 0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)为流动相梯度洗脱，通过调整流动相洗脱条件，葛根素主峰位置始终有阴性干扰。参考相关文献[10]，改变流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液，采用等度洗脱40 min后仍有色谱峰，为缩短运行时间，最终采用梯度洗脱方法。该方法可提高检测效率，减少溶剂用量。

3.3 前处理方法的考察与优化 对照品溶液采用甲醇为稀释溶剂，经重复性验证，绿原酸的主峰良好，但葛根素主峰前始终有一色谱峰干扰。参考《中国兽药典》2020版二部葛根项下，以30%乙醇为稀释溶剂，该条件下基线平稳，绿原酸和葛根素主峰无干扰。曾分别采用10%乙醇、30%乙醇、50%甲醇、甲醇为提取溶剂制备供试品溶液，结果50%甲醇和甲醇提取的样品容量瓶底部产生较多絮状沉淀，影响体积的准确性，10%乙醇和30%乙醇提取的样品比较澄清，综合考虑，选择和对照品溶液一致，以30%乙醇为提取溶剂。进而比较了直接摇匀提取和超声提取法，结果二者含量无明显差异，因此选择更为简便的直接摇匀提取。

本文建立了一个同时测定双葛止泻口服液中绿原酸和葛根素含量的方法，该方法简单、准确、专属性强，可用于双葛止泻口服液的质量控制。