基于纳米材料的免疫层析试纸在兽药残留检测中的应用

杨娅林，陆彦蓉，殷晓阳，李华明，彭大鹏

(华中农业大学，中国农业科学院深圳农业基因组研究所，国家兽药残留基准实验室，武汉 430070)

兽药，尤其是抗微生物药物，大量用于动物疾病的治疗、预防以及饲料添加剂，其残留会影响人或动物的健康，如出现过敏反应、耐药性增强、生殖危害及癌症等。快速检测是保证食品安全，减少兽药残留的重要手段，仪器分析法[1]、酶联免疫吸附法(ELISA)[2]是目前常用的检测方式。仪器分析法的操作专业性、对使用场所的要求限制了其现场检测的发展，ELISA尽管具有现场检测优势，但繁琐的操作过程，无法完成大规模食品筛选，且检测结果易受到环境影响。免疫层析试纸主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板构成，以标记材料的特殊性质作为检测信号，检测卡的使用形式不受限于场所、操作人员，具有操作简单、检测时间短、灵敏度高及成本低等优势，是实现现场检测、大量样品筛选的重要方法。因此，文章以胶体金、量子点、磁性纳米材料、时间分辨荧光微球作为综述对象，对他们的优缺点以及在兽药残留检测中的应用进行阐述，展望免疫层析试纸技术未来应用趋势，以期提供新的发展思路，保证食品安全。

1 基于胶体金纳米材料的检测方法

胶体金(Colloidal gold，CG)主要通过还原氯金酸制备而成，以静电吸附方式与蛋白质结合而不改变其生物特性，在硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上与抗原发生特异性反应后，胶体金聚集显示红色，最终通过对比检测线间颜色深浅判定阴性、阳性的检测结果(图1)。

图1 胶体金试纸检测原理(A)、结果判定方法(B)Fig 1 Colloidal gold assay strip principle(A)、result reading method(B)

基于胶体金纳米材料的免疫层析方法在兽药残留检测领域有着重要地位。在已发表的免疫层析相关文献中，约有75%的标记材料都是胶体金[3]。如表1所示，目前胶体金试纸的检测范围几乎包括所有的抗微生物药物种类，检测样品涉及到水产品、肉类、禽蛋、乳制品等动物源性食品，以及尿液、血清等生物样品，3～20 min可完成检测，除此以外，胶体金试纸已实现多种药物联合检测，可基本满足大规模的食品筛选。

表1 胶体金免疫层析试纸的应用Tab 1 Application of colloidal gold immunochromatographic assay strip

传统的胶体金免疫层析试纸主要通过肉眼对比检测线颜色深浅判定结果。这种判读方式往往受检测人员主观意识影响，检测结果差异大，检测灵敏度有限。为提高检测的灵敏度和准确性，研究人员将银离子沉积在金粒子表面[15]，或将球形金粒子改变为爆米花或纳米星形状[16]，增强胶体金的视觉可见性，以此减小检测误差，检测灵敏度可提高5～10倍以上。另一方面，研究者也开发出光学检测仪代替肉眼判读，将C、T线的色密度转化为光密度进行处理，由于色密度信号仅来自于NC膜表面10 μm，其中约有90%的信号因光散射、折射等原因出现损失[17]，所以这种信号转化后的结果准确性尚有待提高。

2 基于磁性纳米材料的检测方法

磁性纳米材料(Magnetite nanoparticles，MNPs)，是一类特殊的纳米级氧化物，可以通过物理法、化学法、生物法等多种途径合成，刚合成的磁性粒子经过表面修饰后，可以增强粒子的物理、化学稳定性，同时提供便于蛋白质偶联的官能团。MNPs有着与胶体金相当的摩尔吸光系数，标记抗体后，与NC膜上的特异性抗原反应显示棕黄色。但如上所述，光学信号易产生损失，NC膜几百微米的实际厚度，以及生物样本中的有色成分，也会影响光学信号的获取。磁信号则不会受到这些因素的影响，同时生物样本几乎无磁性，磁珠富集后的磁信号可被准确测量，因此磁性试纸有着更高的准确度、灵敏度。孙虹[18]使用MNPs作为标记物检测养殖用水、鱼肉中的孔雀石绿残留，25 min可获得检测结果，定量限为0.6、0.9 μg/L，与市售胶体金试纸经检测对比后，该磁性试纸具有更高的灵敏度。此外，磁性试纸特异性更强，相比于传统的仪器分析法，耗时更短且操作简单。Yan[19]在检测呋喃唑酮分析物时，用MNPs分别标记单克隆抗体、羊抗鼠抗体，利用两种抗体的特异性结合，起到信号增强作用，检测限低至0.044 μg/L，磁性试纸检测灵敏度进一步提高5～10倍。虽然MNPs的合成方法较多，却依旧缺少成熟、稳定的合成途径，适用于免疫层析的MNPs较少，因此，在兽药残留检测中很难看到磁性试纸，昂贵的进口检测仪器也是制约因素之一。

表2 磁性免疫层析试纸的应用Tab 2 Application of magnetic immunochromatographic assay strip

MNPs经修饰后仍能表现出优异的磁性，只需外加磁场就可实现溶液中磁珠快速分离，对于其他纳米材料，磁性特性使MNPs在免疫层析试纸上应用更广泛，例如检测前的样品处理。免疫层析试纸无法对待测物进行精准选择，加之检测形式简单，动物样品中的蛋白、脂肪等基质易对检测结果产生干扰。MNPs经蛋白质修饰后，可与目标分析物特异性结合，通过外加磁场实现目标分析物的快速分离，合适洗脱后可得到高纯度目标分析物，被称为磁分离技术(图2)，利用该技术处理样品可大幅减少有机溶剂使用，洗脱后的MNPs还可重复利用，具有环保、经济优势，是磁性纳米材料除标记材料的特殊应用。Zhang[25]使用该技术处理粗样品，最终获得高纯度氯霉素类似物，整个过程简单、快速，可有效提高后续检测准确性。于是，研究者便将磁分离技术与胶体金试纸条结合(表2)，相比于传统处理方式，这种结合模式，能有效提高胶体金试纸灵敏度10倍以上。

图2 磁分离技术Fig 2 Magnetic separation technology

3 基于量子点的检测方法

量子点(Quantum dots，QDs)是由Ⅱ-Ⅵ族元素、Ⅲ-Ⅴ族元素或Ⅳ-Ⅵ族元素组成，具有发光特性的一种半导体纳米晶体，比罗丹明、荧光素等传统荧光染料，吸收波长更大，荧光强度更高，常使用以CdSe、CdS或CdTe为核心，ZnS或ZnSe钝化后的核壳量子点作标记材料。

Beloglazova[26]对牛奶样本仅采用稀释处理，检测其中的庆大霉素残留，对量子点试纸、胶体金试纸的检测效果进行对比。结果表明，QDs检测灵敏度比CG高5倍，量子点试纸假阳性率、假阴性率分别为2.4%、2.1%，均低于胶体金试纸(4.3%、3.2%)。这是因为QDs与抗体共价连接，比静电吸附作用更加牢固，因此，抗干扰能力更强，且荧光信号较光学信号更易区分阳性、阴性结果，借助荧光信号检测仪器，可以获得更低检测限。

Taranova[27]使用525 nm(绿色)、585 nm(黄色)、625 nm(红色)三种不同颜色的QDs作检测信号，检测牛奶中氧氟沙星、氯霉素、链霉素三种药物残留，检测限分别为0.3、0.12、0.2 μg/mL，检测误差低于8%，10 min就能完成三种药物检测，因检测过程中，荧光颜色的变化形似红绿灯，又被称为“红绿灯”信号试纸(图3)。QDs可以通过改变其合成成分、粒径，在相同波长激发时表现多色荧光，这一特性让QDs在多种药物同时检测中，仍能保持良好区分性，为不同药物的准确定量提供了保证。

图3 多色荧光试纸(A)、链霉素阳性(B)、氧氟沙星和氯霉素阳性(C)Fig 3 Multicolor fluorescence assay paper(A)、Streptomycinpositive(B)、Ofloxacin and Chloramphenicol positive(C)

如表3所示，量子点试纸已应用于肉类、奶制品及生物样品的检测，在莱克多巴胺，以及链霉素、四环素、青霉素联合检测中，检测限低至ng量级。尽管如此，研究者发现某些蛋白质或溶剂分子会使QDs荧光强度下降或淬灭，于是研究者将大量QDs包裹在聚苯乙烯、二氧化硅等纳米微球内，以增强QDs荧光稳定性。同时，纳米微球包裹技术可以一定程度上隔绝Cd元素，避免生物毒性。InP、CuInS2、Ag2S等无镉量子点，因无毒、环保优势逐渐成为研究热点，Beloglazova[28]首次成功制备InP/ZnS无镉量子点试纸，可以灵敏检测两种霉菌毒素，方法简单且经济高效，但因无镉量子点制备困难，因此未在兽药残留检测广泛应用。

表3 量子点免疫层析试纸的应用Tab 3 Application of quantum dot immunochromatographic assay strip

4 基于时间分辨荧光微球的检测方法

时间分辨荧光微球(Time-resolved fluorescence microsphere，TRFM)，是将镧系元素络合物封装在聚苯乙烯，或二氧化硅纳米微球中的一种新型微球，可以提供稳定、高强度的荧光信号，常用Eu(Ⅲ)系荧光微球。TRFM具有更大的Stokes位移，荧光穿透力、抗干扰能力更强，不易出现荧光淬灭现象，与非特异性荧光背景区分性好，几乎无生物毒性。

如表4所示，Li[35]首次构建Eu(Ⅲ)元素时间分辨荧光试纸，检测地塞米松残留，牛奶、猪肉的定量限分别为0.003 μg/L、0.062 μg/kg，10 min可完成检测。Wang[36]制备的TRFM试纸，氯丙嗪检测限为0.32 μg/kg，线性范围更宽(0.46～10.0 μg/kg)，线性关系较好(R2=0.991)，样品预处理后，6 min内就可完成检测。可见，TRFM具有较高的检测灵敏度，能够对兽药残留检测进行定量检测。

表4 时间分辨荧光微球免疫层析试纸的应用Tab 4 Application of time-resolved fluorescent microsphereimmunochromatographic assay strip

Hu[29]首次对TRFM、乳胶微球、QDs、CG的灵敏度及标记消耗量进行系统比较。同比于量子点试纸，时间分辨荧光试纸灵敏度提高3～4倍，为7.2 ng/L。乳胶微球、QDs和CG抗体标记量分别是0.02、0.054和 0.15 μg， TRFM抗体标记量仅为0.005 μg。时间分辨荧光试纸T线包被抗原浓度0.4 mg/mL，其余三种试纸T线包被抗原浓度0.8 mg/mL。同时，时间分辨荧光试纸检测范围最大，检测时间最短，准确度最高，检测结果与LC-MS/MS、商品化ELISA试剂盒一致。

综上所述，时间分辨荧光试纸灵敏度更高、检测范围更大、抗原抗体消耗更少，能够为兽药残留检测提供新型、高效、经济的检测方式。目前，时间分辨荧光试纸在兽药残留检测的应用处于起步阶段，这是因为TRFM的生产技术不成熟，仍需依赖商品化微球，而商品化微球还存在分散性、荧光强度不稳定现象。

5 展 望

综上，每种纳米材料的优缺点如表5所示。纳米材料为免疫层析试纸提供了特殊检测信号，大幅提高免疫层析试纸检测灵敏度，并实现定量分析，其中MNPs因特有的磁性特性，为免疫层析试纸提供新的样品处理方式，以保证结果准确性。

表5 纳米材料特点Tab 5 Characteristics of Nanomaterials

基于此，为应对动物食品中多种药物及其代谢物残留现状，免疫层析试纸还应具备多重分析功能，经总结多重分析试纸主要有以下几种应用趋势：

5.1 多检测线试纸 多检测线是指增加检测线数量，在一条试纸上检测不同药物(图4A)。为防止检测线互相干扰，需要灵敏度、特异性更强的抗体，由于免疫探针在流动过程中，易出现稀释、反应缓慢等现象，进而会影响药物检测灵敏度，因此，待测物至检测线距离应着重考虑。

5.2 多通道检测 多通道检测是将检测同种、不同种药物的试纸条，组装在一个检测平台的检测方式，每一条试纸拥有单独加样槽、阅读窗，可根据检测需求，增减平台试纸数量，是当前商品化多重分析试纸的主要检测方式(图4B)。

5.3 矩阵检测 相同区域下，点状在数量上更具优势，将线性检测线用点阵代替，可极大增加检测数量，抗原包被数量可达32种(图4C)。目前，矩阵检测试纸已在传染病诊断、病原体检测中应用，但由于检测区域缩小，易受液体流速不均等外界因素干扰，尚无法保证结果准确性，在兽药残留检测中应用较少。

图4 多检测线试纸(A)、多通道检测(B)、矩阵检测(C)Fig 4 Multi-detection line assay paper(A)、Multi-channeldetection(B)、Matrix detection(C)

定量分析是保证检测结果准确的重要手段。MNPs、QDs和TRFM的应用，实现了数据化处理、存储和运输，结果准确性大大提高。2010-2019年间，免疫层析试纸在食品安全中的应用量快速增长。其中，传统比色法试纸使用量减少，定量分析试纸使用量增多且呈几倍增长，这得益于信号检测仪器的开发与应用，为满足现场快检需求，这些检测仪器逐渐趋向于小型化、便携化。大众食品安全意识的提高，将带来家庭检测需求，智能手机的普及与发展，将促进家庭化、智能化、大众化的新型阅读方式形成，不断推动兽药残留检测技术发展。