抑制SSRP1对胶质瘤细胞增殖、化疗敏感性的影响

陶 祥 张文斐 冀保卫 张 戈 陈治标

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤。近些年，随着神经外科显微技术、放化疗技术等进展，胶质瘤的治疗取得一定的进步，但其病死率仍居高不下。胶质瘤细胞恶性增殖、对放化疗的抵抗性、复发是导致病人最终死亡的重要原因。胶质瘤发生和进展的分子机制非常复杂，探索其分子机制对开发新的治疗策略非常重要。结构特异性识别蛋1（structure specific recognition protein 1，SSRP1）是促进染色质转录复合体形成的亚基。研究表明SSRP1主要通过调控核小体的合成与降解，参与DNA损伤修复、转录调控、细胞凋亡和周期调控[1，2]。SSRP1表达上调与多种肿瘤的不良临床病理特征和恶性预后相关，如结直肠癌[3，4]、膀胱癌[5]、肝细胞癌[6～8]、胃癌[9]、恶性黑色素瘤[10]。然而，SSRP1 在胶质瘤中的临床病理学意义和生物功能作用尚不清楚。丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase,MAPK）信号通路在胶质瘤中常常为过度激活状态[11]，与胶质瘤不良预后有关[12]。本文探讨SSRP1与胶质瘤细胞增殖、化疗敏感性的关系，及MAPK信号在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 生信分析 胶质瘤临床资料下载自中国脑胶质瘤基因组计划CGGA（http://cgga.org.cn/），包括全外显子序列数据集WEseq_286，mRNA 数据集mRNAseq_325、mRNAseq_693 和mRNA_array_301（以上原始数据均可在http://cgga.org.cn/download.jsp 下载）。数据集中包含有性别、年龄、WHO 级别及组织学分型、总体生存期（overall survival，OS）、是否放疗、是否化疗、IDH突变情况、1p/19q是否有联合缺失以及相应的基因表达数据。

1.2 细胞培养 人脑胶质瘤细胞系U251、U87细胞[中国科学院（上海）细胞库]培养于含10%胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）的DMEM 培养基（美国Gibco 公司）培养，每3 天一次以含EDTA 的0.25%胰酶消化，1：3传代。

1.3 细胞分组 将U251、U87 细胞接种96 孔板，每孔100 μl（含1×105个细胞），分为SSRP1 抑制剂组和对照组。SSRP1 抑制剂组加入终浓度为600 nmol/L 的CBL0137（上海东苍生物公司），对照组加入等体积PBS。检测化疗敏感性时，SSRP1 抑制剂组在CBL0137 作用基础上，加入替莫唑胺（temozolomide，TMZ；上海瀚香生物科技有限公司），浓度分别为30、60、90、120、150 μmol/L；对照组加入等体积PBS。

1.4 CCK8法检测细胞增殖 将对数生长期细胞接种于96 孔板培养24、48、72 h，按CCK8 试剂盒（日本Dojindo 公司）说明书操作，用酶标仪检测450 nm 处吸光度。每组设3个复孔，重复3次。

1.5 免疫印迹法检测蛋白表达 使用添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。40 μg/孔上样后行常规变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。湿法转移蛋白到PVDF 膜上，5%胎牛血清溶液室温封闭2 h，加入一抗（1:800）4 ℃孵育过夜，加入二抗（1:5 000）室温孵育1 h，ECL发光液孵育后显影和定影。抗SSRP1 抗体购自英国Cambridge 公司，抗GAPDH、p-p-38、p-ERK、p-JNK、p-38、ERK、JNK 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司，抗鼠或抗兔HRP 标记的二抗购自美国Promega Biotechnology公司。

1.6 统计学分析 使用SPSS 19.0软件分析；计量资料用±s表示，使用t检验；P＜0.05表示差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 生信分析结果WEseq_286 分析结果显示，286例胶质瘤基因组外显子序列中，283 例为野生型，3例为突变型（1%，3/286；图1A）。mRNAseq_325 和mRNA_array_301 分析显示，WHO 分级Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤SSRP1 表达水平较WHO 分级Ⅱ级胶质瘤明显上调（P＜0.05；图1B、1C）。

图1 胶质瘤组织SSRP1表达

mRNAseq_325、mRNAseq_693 分析显示1p/19q联合缺失型低级别胶质瘤（low grade glioma，LGG）的SSRP1 表达明显下调，IDH 野生型LGG 的SSRP1 表达明显下调；IDH 野生型胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）的SSRP1表达明显下调（图2 A、2B）；与原发性胶质瘤相比，复发性胶质瘤SSRP1 表达显著上调（图2C、2D）。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，SSRP1 低表达组病人OS明显优于高表达组（图3）。

图2 胶质瘤SSRP1表达与IDH突变、1p/19q缺失以及肿瘤复发的关系

图3 胶质瘤SSRP1表达与病人预后的关系

2.2 抑制SSRP1抑制胶质瘤细胞系U251及U87细胞增殖 与对照组相比，SSRP1 抑制剂组U251、U87 细胞增殖受到显著抑制（P＜0.05；图4）。

图4 抑制SSRP1抑制胶质瘤U251细胞、U87细胞增殖

2.3 抑制SSRP1 增加U251 及U87 细胞对TMZ 的化疗敏感性 随TMZ 浓度增高，U251、U87 细胞增殖能力明显降低（P＜0.05）；与对照组相比，SSRP1抑制剂组U251、U87细胞增殖能力明显降低（P＜0.05；图5）。

图5 抑制SSRP1增强胶质瘤U251细胞、U87细胞对TMZ的化疗敏感性

2.4 抑制SSRP1 抑制U251、U8 细胞MAPK 信号通路与对照组相比，SSRP1组MAPK信号通路p-38、ERK及JNK 蛋白水平无明显改变（P＞0.05；图6），但磷酸化水平显著下降（P＜0.05；图6）。

图6 抑制SSRP1抑制胶质瘤U251细胞、U87细胞MAPK信号通路

3 讨论

我们的研究表明SSRP1 与胶质瘤WHO 级别、IDH 突变、1p/19q 联合缺失、肿瘤复发和OS 相关。显微手术切除联合放化疗仍是胶质瘤的重要治疗方法，如何克服肿瘤细胞的放化疗抗性是重要的研究方向。CBL0137 最初用于调控P53 及NF-κB，尝试解决肿瘤细胞的化疗抵抗性，然而后来的研究发现CBL0137可特异性抑制FACT，在多种恶性肿瘤中具有明显抗肿瘤作用，如肾细胞癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤和小细胞肺癌。据报道，CBL0137 可促进胶质瘤干细胞失活及凋亡[13]，还可通过激活Notch1 抑制小细胞肺癌中干细胞样细胞与顺铂产生协同作用[14]，增强肺癌化疗敏感性[15]。我们的研究表明CBL0137 可显著抑制胶质瘤细胞增殖，促进胶质瘤细胞对TMZ 的化疗敏感性，其机制可能与抑制SSRP1 进而抑制MAPK 信号通路有关。MAPK 信号通路与胶质瘤的相关研究报道较多。lncRNA MATN1-AS1 调控MAPK 信号通路，抑制GBM 细胞增殖和侵袭[16]。环状RNA MAPK4 调控miR-125a-3p，抑制MAPK 信号通路介导胶质瘤细胞凋亡[17]。GBM的ZDHHC17基因显著上调，激活MAPK信号通路的重要组成部分p38/JNK，导致GBM 恶性进展[18]。lncRNA SNHG5 通 过p38 信 号 通 路 促 进GBM 细胞增殖[19]。洋椿苦素可负调节MAPK 信号通路，抑制耐TMZ 胶质瘤细胞的生长、微血管生成及细胞周期紊乱，促进细胞凋亡[20]。

总之，胶质瘤SSRP1呈高表达，与病人不良预后有关。抑制SSRP1，可通过抑制MAPK信号通路，抑制胶质瘤细胞增殖，增加胶质瘤细胞对TMZ 的化疗敏感性。