脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1预测脑胶质瘤复发的价值

刘玉川 崔彦魁 程 鹏

胶质瘤是颅内常见肿瘤之一，术后易复发。研究显示，复发性脑胶质瘤的中位生存时间在3～6 个月[1]。外泌体是一种直径在40～100 nm的盘状囊泡，存在于血液、脑脊液、尿液和唾液等体液中[2]，参与细胞信号转导并影响肿瘤细胞恶性生物学特征[2，3]。相比于体液长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），外泌体lncRNA 更易检测，也更准确反映肿瘤细胞真实lncRNA的表达水平[4]。细胞因子信号转导抑制因子2-反义转录本1（suppressor of cytokine signaling 2-antisense transcript 1，SOCS2-AS1）是新发现的lncRNA，影响肿瘤细胞凋亡、侵袭、迁移等[5～7]。本文探讨脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1预测脑胶质瘤术后复发的价值。

1 资料与方法

1.1 病例选择标准 纳入标准：组织病理学检测证实为脑胶质瘤；术后完成2～4个疗程放疗、化疗或同步放化疗；病例资料完整。排除标准：合并其他部位肿瘤；合并其他脑部疾病；既往有脑部手术史；合并严重心肝肾疾病；存在急慢性感染；合并免疫性疾病。

1.2 一般资料2017年1月至2018年1月收治符合标准的脑胶质瘤84例，其中男49例，女35例；年龄35～79岁，平均（49.30±10.02）岁；高级别胶质瘤46例，低级别胶质瘤38例。选取将康体检者30例为对照，其中男18 例，女12 例；年龄28～54 岁，平均（48.23±8.23）岁。本研究经我院伦理委员会批准，病人均签署知情同意书。

1.3 外泌体的分离和鉴定 腰椎穿刺术取脑脊液1.5 ml。1 500 转/min 离心15 min，留取上清液。用外泌体分离试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）分离外泌体，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

取10 μl外泌体悬液滴加于铜网上沉淀60 s，用滤纸吸取悬液。取醋酸双氧铀10 μl 滴加于铜网上沉淀60 s，吸干液体。在常温下干燥10 min，用Tecnai Spirit G2 透射电子显微镜观察外泌体形态。采用英国NanoSight 纳米颗粒分析仪检测外泌体粒径分布及浓度。采用免疫印迹法检测外泌体表面标志蛋白CD63 和TSG101[8]，步骤如下：取100 μl 外泌体，加入RIPA 细胞裂解液，提取蛋白；进行SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白并电转至PVDF 膜上；用5%脱脂牛奶封闭，加入兔抗人CD63 单克隆抗体（1:1 000，美国Sigma 公司）或兔抗人TSG101 单克隆抗体（1:500，美国Sigma公司），4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，加入羊抗兔二抗，温室孵育1 h，再用TBST洗涤3次。最后用ECL显影。

1.4 RT-PCR检测脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1的表达水平 用外泌体RNA 提取试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）提取外泌体总RNA。用Prime-Script RT试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）进行逆转录，获得cDNA。随后用SYBR Green试剂盒（上海联迈生物工程有限公司）对cDNA 进行扩增。反应条件：94 ℃、10 min，94 ℃、45 s；60 ℃、45 s；72 ℃、45 s；共 计40 个 循 环。SOCS2-AS1 上 游 引 物5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下 游 引 物5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。用2-ΔΔCt计算相对表达量。以lncRNA SOCS2-AS1 相对表达量中位数为截断值，将胶质瘤分为高表达组和低表达组。

1.5 随访 术后门诊或电话随访，随访时间1～36 个月。复发定义为：肿瘤生长范围较术前扩大或者肿瘤出现在不同部位[9]。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0进行分析；计量资料用±s表示，用t检验；计数资料用χ2检验；采用多因素logistic 回归模型分析脑胶质瘤复发的影响因素；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 水平预测脑胶质瘤复发的价值，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）、灵敏度和特异度；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液外泌体鉴定结果 透射电子显微镜观察显示，脑脊液外泌体直径约100 nm（图1A）；免疫印迹法检测结果显示胶质瘤组及对照组脑脊液外泌体均表达CD63 和TSG101 蛋白（图1B）；Nanosight 检测发现，外泌体直径平均138.2 nm，浓度平均为2.30×1011个颗粒/ml（图1C）。

图1 脑脊液外泌体鉴定结果

2.2 胶质瘤病人脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1的表达水平 胶质瘤组脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 相对表达量[（1.45±0.25）]明显高于对照组[（0.56±0.12），P＜0.001]。高级别胶质瘤脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 相对表达量为[（1.87±0.51）]明显高于低级别胶质瘤[（1.04±0.28），P＜0.001]。

2.3 脑胶质瘤术后复发的影响因素 单因素分析显示，肿瘤直径、肿瘤分级、肿瘤切除程度、脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 表达水平与脑胶质瘤术后复发有关（P＜0.05，表1）。多因素logistic 回归分析显示，肿瘤直径≥5 cm、高级别胶质瘤、肿瘤未全切除、脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 高表达是术后复发的独立影响因素（P＜0.05，表1）。

表1 脑胶质瘤术后复发危险因素的logistic回归分析

2.4 脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 水平预测脑胶质瘤术后复发的价值ROC曲线分析显示，脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 高表达预测脑胶质瘤术后复发的AUC 为0.917，灵敏度为85.78%，特异度为93.10%。见图2。

图2 ROC曲线分析脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1水平预测脑胶质瘤术后复发的价值

3 讨论

胶质瘤通常呈侵袭性生长，边界不清楚，手术不易完全切除，因此术后容易复发[10]。外泌体是一种内源性囊泡，能够运输脂质、核苷酸、非编码RNA及蛋白质等[3]。肿瘤细胞可以通过外泌体将活性分子传递给受体细胞，影响受体细胞功能；另外，外泌体运载的活性分子可以与肿瘤微环境中巨噬细胞相互作用，加速肿瘤进展[11]。lncRNA 在表观遗传、转录及转录后水平影响基因表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等密切相关。外泌体源性lncRNA参与脑胶质瘤的发生、发展，在脑胶质瘤诊断、治疗和预 后 评 估 中 发 挥 重 要 作 用[4，12，13]。lncRNA SOCS2-AS1 是近年来新发现的lncRNA，在转录水平起调节作用，影响肿瘤进展[5～7]。有研究发现，lncRNA SOCS2-AS1在前列腺癌组织[5]、脑胶质瘤组织[14]中高表达，并且与病人不良生存预后有关。本文发现，脑胶质瘤病人脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 表达水平升高，并且高级别胶质瘤的表达水平明显高于低级别胶质瘤，提示lncRNA SOCS2-AS1 可能参与脑胶质瘤发生、发展。

影响脑胶质瘤术后复发的因素较多。本文发现肿瘤直径、肿瘤分级、肿瘤切除范围是脑胶质瘤术后复发的影响因素，与既往报道一致[8，15，16]。肿瘤侵袭性增长是胶质瘤术后复发的重要影响因素。lncRNA SOCS2-AS1 可 通 过miR-1264 信 号 通 路[7]、ITGB1 信号通路[14]等促进肿瘤细胞侵袭。本文单因素logistic 回归分析和ROC 曲线分析显示lncRNA SOCS2-AS1 与脑胶质瘤术后复发的关系，结果显示lncRNA SOCS2-AS1 高表达是脑胶质瘤术后复发的独立影响因素，并且有较高的预测价值，灵敏度为85.78%，特异度为93.10%。

总之，脑胶质瘤病人脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1 表达水平升高，脑脊液外泌体lncRNA SOCS2-AS1高表达对脑胶质瘤术后复发有较高的的预测价值。