不同来源β-葡聚糖对旋毛虫感染C57BL/6J小鼠的影响

董子健，金雪敏，庞建达，唐 斌，马晓晓，刘明远，杨 丽，刘晓雷

(吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062)

旋毛虫病(trichinellosis)是由旋毛虫(Trichinella)感染引起的食源性人兽共患寄生虫病，旋毛虫可感染包括人类在内的150多种动物，对畜牧业造成了巨大经济损失并严重威胁人类健康[1]。生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫的肉制品是人感染旋毛虫的主要原因[2]。人感染旋毛虫的过程可分为3个阶段：肠道阶段主要表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻；肠外阶段主要表现为发热、厌食、皮疹和面部水肿，严重时可导致死亡；包囊阶段主要表现为发热、肌肉剧烈疼痛，严重时呼吸困难[3-4]。目前，旋毛虫病在俄罗斯、越南、老挝、泰国及南美等国家和地区仍广泛流行[5]。在我国，旋毛虫发病率呈上升趋势，1964-2011年共计有600多起人旋毛虫病暴发的疫情报道，38 797人发病，336人死亡[6-7]。近几年，我国西南地区暴发多起人体旋毛虫病，其中云南省发病率最高。2000年至今，云南省共计有21起人体旋毛虫病暴发的疫情报道，2 256人发病，3人死亡[5]。我国农业部于2009年将旋毛虫病列入26种最危险的人兽共患传染病名录[6]。因此，对旋毛虫病的防控工作不容忽视。

β-葡聚糖是一类广泛存在于酵母、蘑菇、细菌、藻类和谷物(例如大麦和燕麦)中的非淀粉多糖，是由D-葡萄糖单体通过β-糖苷键连接而成的[8]。β-葡聚糖除具有降胆固醇、降血糖、抗肿瘤和抗炎等多种有益生理作用外，还可以改善肠道屏障、抵抗病原微生物入侵[9]。肠道屏障是宿主抗胃肠道蠕虫感染的第一道屏障，由外层的黏液层及肠道菌群、中间层的肠上皮细胞和固有层的免疫细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)构成[10]。肠道黏液层主要成分为水、杯状细胞分泌的黏蛋白(主要为黏蛋白2,Muc2)、免疫分子、抗菌肽、分泌型免疫球蛋白A等。这些成分具有预防异物入侵肠上皮细胞、免疫调节等功能[11]，同时黏液层在抵抗蠕虫入侵过程中也发挥重要作用，据报道Muc2缺陷可导致小鼠旋毛虫排虫时间延长[12]。肠道菌群由100万亿种微生物组成，在营养吸收、代谢、病原体防御和免疫细胞发育起到至关重要的作用，同时肠道菌群可以通过厌氧发酵产生短链脂肪酸以促进杯状细胞分泌黏蛋白以增加黏液层厚度和重组肠上皮细胞紧密连接[13-14]。

本试验旨在探究燕麦β-葡聚糖(OBG)和香菇多糖(LNT)对旋毛虫感染C57BL/6J小鼠的影响，为预防和治疗旋毛虫病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 虫株及试验动物旋毛虫(国际标准虫种编号ISS534)由吉林大学食源性寄生虫病实验室保种；4～6周龄雌性C57BL/6J小鼠，体质量18～22 g，购自吉林大学医学部动物中心。

1.2 主要试剂OBG购自默克生命科学公司；LNT购自MedChemExpres公司；TRIzol试剂和TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购自北京全式金生物公司；PowerUpTMSYBR®Green预混液购自赛默飞世尔科技公司；Muc2多克隆抗体和免疫组化试剂盒购自Abcam生物公司；Muc2 和GAPDHqPCR引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。

表1 qPCR所用引物序列

1.3 试验分组将48只雌性C57BL/6J小鼠随机分为OBG处理组、LNT处理组、感染组和空白对照组等4个组，每组小鼠各12只。OBG处理组和LNT处理组分别连续14 d口服OBG和LNT (剂量为每天40 mg/kg) 后，以500条肌幼虫/鼠的剂量经口灌胃感染各小鼠，再连续7 d口服OBG和LNT。感染组每只小鼠感染等量旋毛虫，空白对照组未处理。

1.4 旋毛虫肌幼虫和成虫荷虫量的检测感染后7 d，每组随机挑选6只小鼠，麻醉后脱颈处死，取小肠，纵向剖开，置于生理盐水37℃孵育3 h，收集并计算成虫数量[15]，同时保存小肠组织做石蜡切片以及总RNA提取。于感染后35 d，将每组剩余小鼠麻醉后脱颈处死，使用人工消化法收集并计算肌幼虫数量[15]。

1.5 qPCR检测Muc2 mRNA表达量使用TRIzol法提取各组感染后7 d小鼠小肠组织总RNA。根据TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒说明书，反转录小肠组织总RNA；并根据PowerUpTMSYBR®Green预混液说明书进行qPCR检测Muc2 基因表达量。

1.6 免疫组织化学法检测Muc2蛋白表达感染7 d 后小鼠小肠组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后，制成5 μm厚的石蜡切片。根据免疫组织化学试剂盒说明书进行免疫组化。

2 结果

2.1 口服OBG和LNT对小鼠肌幼虫和成虫荷虫量的影响与感染组相比，OBG处理组和LNT处理组小鼠旋毛虫成虫荷虫量呈极显著性差异(P<0.001)(图1A)，同时OBG和LNT有效降低了小鼠旋毛虫肌幼虫荷虫量(图1B)。但是OBG处理组和LNT处理组之间小鼠旋毛虫肌幼虫和成虫荷虫量未见显著性差异(P>0.05)(图1B)。

A.OBG和LNT对小鼠旋毛虫成虫荷虫量影响；B.OBG和LNT对小鼠旋毛虫肌幼虫荷虫量的影响。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。下同

2.2 OBG和LNT对Muc2 mRNA表达量的影响与空白对照组相比，感染组、OBG处理组和LNT处理组小肠Muc2基因表达水平显著升高(P<0.001)。OBG处理组和LNT处理组，与感染组相比，小肠Muc2基因表达量显著升高。但OBG处理组和LNT处理组之间小肠Muc2基因表达量无显著性差异(P>0.05)(图2)。

图2 感染后7 d小鼠肠道Muc2 mRNA表达量

2.3 OBG和LNT对Muc2蛋白表达量的影响各组Muc2蛋白表达水平与基因表达水平基本一致。与空白对照组相比，感染组、OBG处理组和LNT处理组小肠组织中棕黄色染色颗粒增多，表明Muc2蛋白表达升高。与感染组相比，OBG处理组和LNT处理组小肠Muc2蛋白表达水平同样升高。但OBG处理组和LNT处理组之间小肠Muc2蛋白表达水平无显著性差异(图3)。

Control.空白对照组，小鼠未经任何处理；Ts.感染组，小鼠只感染旋毛虫，未经其他处理；Ts+OBG处理组.连续14 d口服OBG，经口感染500条旋毛虫肌幼虫，再连续7 d口服OBG；Ts+LNT处理组.连续14 d口服LNT，经口感染500条旋毛虫肌幼虫，再连续7 d口服LNT

3 讨论

全球约10亿人面临蠕虫感染的威胁，如何降低蠕虫感染率和流行率已然成为全球公共卫生领域中亟待解决的问题[16]。蠕虫感染主要发生于热带和亚热带地域，尤其在发展中和不发达地区，由于环境因素和卫生条件因素蠕虫感染率居高不下[17]。

随着功能性食品研究领域的发展，β-葡聚糖的多种有益生理作用也被发现。在一项临床试验中发现，食入富含β-葡聚糖的硬质小麦粉和全麦面粉提升了罗氏菌、梭菌和瘤胃球菌属相对丰度，同时短链脂肪酸含量提升[18-20]。除此之外，β-葡聚糖具有治疗肠胃道疾病的作用，β-葡聚糖明显改善了仔猪感染轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌后的腹泻情况，并降低了仔猪病死率[21-22]。同时β-葡聚糖也能显著提升宿主抗蠕虫感染能力[23-24]。本试验结果表明，在剂量为每天40 mg/kg情况下，连续14 d口服OBG和LNT可以显著降低小鼠旋毛虫成虫和肌幼虫荷虫量，提示OBG和LNT可以有效治疗小鼠旋毛虫感染。

Muc2蛋白是由杯状细胞表达的一种分泌蛋白，后被报道为黏液的关键成分[25]。Muc2蛋白在保护肠道和维持肠道内环境稳态起着至关重要的作用，相关研究表明，Muc2蛋白水平降低与炎症性肠炎及某些癌症的发生发展有关[26-27]。同时，在一系列由寄生虫、病毒和细菌引起的肠道感染过程中，也观察到了Muc2蛋白表达变化，在鸡蛔虫、巴西日圆线虫和鼠鞭虫感染过程中，Muc2蛋白表达量明显上升[27]。本试验结果表明，OBG和LNT可以提升Muc2基因和蛋白表达量，提示OBG和LNT可能通过增强小鼠肠道黏膜免疫促进排虫以抵抗旋毛虫感染。

近些年研究发现，尽管所有连接葡萄糖单体的糖苷键类型相似，但不同来源β-葡聚糖糖苷键键长、糖苷键位置、分支程度以及三级结构各有不同，导致其生物学功效也不尽相同[28]。与喂食低黏度葡聚糖相比，喂食高黏度葡聚糖更能提升试验大鼠肠道乳酸杆菌相对丰度[29]。OBG由β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键连接形成，而LNT具有β-1，3糖苷键和β-1，6糖苷键，分别负责线性结构和主要分支[28]。本试验结果表明，OBG和LNT在剂量为每天40 mg/kg 情况下，小鼠旋毛虫成虫和肌幼虫荷虫量和Muc2蛋白表达量并无显著性差异，这可能是由于剂量较高导致，或者在抗旋毛虫感染过程中两者效果基本一致。同时，已知大麦葡聚糖可以通过调节肠道菌群，促进肠黏液分泌以抵抗旋毛虫入侵[24]，同样OBG和LNT是否通过调节肠道黏膜免疫，促进黏液分泌以抵抗旋毛虫入侵，这些都有待进一步研究证实。

本试验结果表明，OBG和LNT可促进小鼠Muc2蛋白表达，降低小鼠旋毛虫肌幼虫和成虫荷虫量，研究结果为预防和治疗旋毛虫病提供新思路。